Análise da expressão diferencial de genes, identificação, seleção e validação de SNPs em genes envolvidos na tolerância da soja ao excesso hídrico

Abstract

A soja é uma leguminosa de grande adaptabilidade climática, sendo uma das oleaginosas mais consumidas e cultivadas no mundo. Entretanto, a produtividade de grãos de soja é afetada por diversos estresses abióticos, entre os quais, está o excesso hídrico. Apesar da variabilidade genética, a soja é considerada sensível ao excesso hídrico e existe crescente demanda por genótipos de soja adaptados, bem como, o entendimento dos mecanismos envolvidos na tolerância a este estresse. O objetivo do presente estudo foi estudar as respostas fisiológicas e moleculares de genótipos de soja ao excesso hídrico. Nesse sentido, genótipos foram avaliados em relação a tolerância ao excesso hídrico em experimentos a campo, condições controladas. Os parâmetros fisiológicos utilizados foram a fluorescência da clorofila, nitrogênio acumulado na parte aérea, atividade da enzina ascorbato peroxidase (APX) e conteúdo de peróxido de hidrogênio (H2O2), para análise molecular foram coletadas folhas para realização do sequenciamento do RNA (RNAseq). A fluorescência da clorofila se mostrou eficiente na caracterização do estresse provocado pelo excesso hídrico, mostrando diferença significativa entre os genótipos. Os resultados em relação à atividade a enzima APX e conteúdo de H2O2 sugerem que no genótipo tolerante a produção de H2O2 pode estar atuando na percepção e sinalização do estresse. Os genótipos estudados apresentam modificações no perfil da expressão de genes em resposta ao alagamento. A utilização do Transcriptograma se mostrou uma ferramenta eficiente que fornece um representativo perfil global de expressão gênica. Apesar da tolerância ao alagamento ser uma característica complexa e de caráter quantitativo, isto é, regulada por diversos genes, foram identificados alguns genes candidatos da família de fatores de transcrição responsivos ao etileno, calmodulina e proteínas de choque térmico apresentaram aumento da expressão no genótipo tolerante em resposta ao excesso hídrico. Foram identificados 23 marcadores SNPs, presentes apenas no genótipo tolerante, homozigotos e com anotação funcional para resposta a estresses abióticos. Para validação dos marcadores foram desenvolvidos ensaios de competição de alelos (KASP). Dois marcadores SNPs GSM0612 e GSM0613 apresentaram associação significativa com fenótipos tolerantes, ambos estão localizados no gene Glyma03g004100, uma proteína calmodulina, que pode estar associada a rotas de sinalização mediadas por cálcio.

Soybean (Glycine max) is a legume of high protein value and great climatic adaptability, being one of the most consumed and cultivated oilseeds in the world. Flooding is a frequent environmental stress that reduces soybean growth and affects nutrient, and water uptake, and grain yield of soybean in many producing areas in the world. Characterization of genomic regions underlying the flooding tolerance will facilitate development of soybean varieties for flooding tolerance. The present study aims to characterize physiological and molecular responses to flooding stress in soybean. Genotypes with contrasting flooding tolerance were grown on field and controlled conditions, the genotypes were subjected to flooding, then leaves and roots were collected at 24 and 48 h after flooding stress, respectively, and used for physiological evaluations and RNAseq analysis. Physiological traits including chlorophyll fluorescence, N uptake, APX activity and H2O2 content were collected. Chlorophyll fluorescence was an efficient parameter to characterize the flooding stress. The sensitive cultivar showed decrease in quantum yield than tolerant cultivar in response to flooding. APX activity only raised in the sensitive genotype. After flooding, the sensitive genotype showed an increase in H2O2, while the tolerant showed a decrease. This result indicates that H2O2 may act as a signaling molecule in the tolerant genotypes. RNAseq analysis identified genes that in response to flooding stress showed the expression profile with expression levels statistically altered. The Transcriptogramer tool provided transcriptome data in a genomewide scale, providing a wide biological scenario. From these data, also has identified 23 SNPs in putative genes responsible for flooding tolerance. The results are being validated with other genotypes. Therefore, were selected and identified SNPs in candidate genes differently expressed under flooding stress, only the SNPs with presence in tolerant genotype and with functional annotation in abiotic stress response. After applying several filters, it were selected 23 SNPs in putative genes responsible for flooding tolerance. Were developed Kompetitive Allele Specific PCR (KASP) assays and two of these SNP markers, designated as GSM0612 and GSM0613, both located in a Calcium Binding Protein that could be associated with calcium cell signaling pathways.