Real time-pcr e nested-pcr no diagnóstico da tuberculose pulmonar

Abstract

A tuberculose (TB) é um importante problema de saúde pública, portanto, é necessário o desenvolvimento de novas ferramentas para a detecção rápida e confiável do Mycobacterium tuberculosis, prevenindo a transmissão da TB. O objetivo deste estudo foi avaliar dois testes moleculares para detecção de bactérias do Complexo Mycobacterium tuberculosis (MTBC) diretamente de amostras clínicas. Foi realizado um estudo transversal, no qual foram selecionadas 124 amostras respiratórias. As amostras foram avaliadas por dois testes moleculares “in house” para detecção do MTBC: NESTED-PCR (NPCR) e Real Time PCR (RT-PCR) ambos com primers para o IS6110. As amostras também foram avaliadas por um teste direto (pesquisa de BAAR). Os resultados foram comparados com a cultura para M.tuberculosis e também com os resultados da cultura juntamente com dados clínicos. Uma amostra comercial com quantificação de DNA conhecida foi utilizada para determinação do Limite de Detecção (LOD) dos testes moleculares. O LOD foi de 1 cópia/μL para o RT-PCR e de 25 cópias/μL para o NPCR. O BAAR apresentou baixa sensibilidade - SE - (40%) e alta especificidade - SP - (94%). Ambos os ensaios moleculares, apresentaram elevada SE e SP (RT-PCR 98% e 91%, NPCR 86% e 93%, respectivamente) em relação à cultura. Quando comparamos os resultados frente a cultura juntamente com os dados clínicos, a SE e a SP foram de 90% e 97% para a RT-PCR e de 80% e 99% para a NPCR, respectivamente. Houve um pequeno decréscimo da SE dos métodos moleculares, quando comparados com a cultura mais os dados clínicos em relação à cultura isoladamente, no entanto, a SP foi consideravelmente elevada para os três métodos avaliados. Avaliamos o custo dos insumos para os ensaios moleculares: o custo do NPCR foi de $ 17.77/teste enquanto que o custo do RT-PCR foi de $ 15.76/teste. Em relação ao tempo de execução dos testes o RT-PCR foi mais rápido (2 horas) do que o NPCR (4 horas). Este estudo confirma que técnicas de PCRs podem ser muito úteis para o diagnóstico rápido da TB respiratória, com altas taxas de SP. Ele também pode ser muito importante para a exclusão de diagnóstico, considerando o alto VPN encontrados no nosso estudo. Os resultados demonstraram que os ensaios moleculares visando IS6110 do M. tuberculosis podem ajudar a melhorar o diagnóstico da TB pulmonar, com muitos potenciais efeitos positivos para a gestão clínica e de controle da doença.

Tuberculosis (TB) remains as an important public health problem worldwide. Therefore, the rapid detection of M. tuberculosis is of primary importance to effectively reduce transmission among patients. The aims of this study were to evaluate two molecular tests to detect M. tuberculosis complex (MTBC) directly from clinical samples. The study included 124 respiratory samples which were evaluated by two in house molecular assays for MTBC detection: Nested PCR (NPCR) and Real Time PCR (RT-PCR). The respiratory samples were also evaluated by the direct test (AFB assay). The results were compared with the results of culture and also compared with the culture results plus clinical data of patients. We used a commercial DNA sample with known quantification to establish the Limit of Detection (LOD). The LOD was 1 copy/μL for RT-PCR and 25 copies/μL for NPCR. The AFB assay presented low sensitivity – SE - (40%) and a high specificity - SP – (94%). Both molecular assays, RT-PCR and NPCR presented high SE and SP (RT-PCR 98% and 91%, NPCR 86% and 93%, respectively) compared to culture. When the results of the molecular tests were compared to the culture plus clinical data the SE and SP were 90,20% and 97,26% for RT-PCR and 80,39% and 98,63% for the NPCR, respectively. It was possible to observe a slight decrease of SE of the molecular methods in comparison to culture plus clinical data in relation to culture; however, the SP was increased, since many cases of TB could not be confirmed by culture. Furthermore we evaluated the cost of molecular assays: the NPCR cost was $17.77/test while the RT-PCR cost was $15.76/test. The RT-PCR test was faster (2 hours) than the NPCR (4 hours) to be performed. Our study confirms that PCRs may be useful for rapid diagnosis of respiratory TB, with high SP rates. It may also be very important to exclude such diagnosis, considering the high NPV found in our study. In summary, PCRs targeting IS6110 of MTB improve the accuracy of the diagnosis of pulmonary TB, with many potential positive effects for clinical management and control of the disease.