Estudos fisiopatológicos em agricultores e mineradores utilizando assinaturas moleculares : transcriptômica, proteômica e alterações epigenéticas

Abstract

A exposição ocupacional a substâncias químicas pode induzir alterações fisiopatológicas que favorecem o desenvolvimento de doenças crônicas não transmissíveis. Destacam-se agricultores, expostos a agroquímicos, e mineradores, à sílica cristalina (SC), agentes carcinogênicos e pró-fibróticos associados ao câncer e à silicose. Este estudo foi dividido em 3 objetivos parciais: (1) investigar os efeitos da exposição aos agroquímicos sobre o dano de DNA e alterações epigenéticas. (2) Estudos ômicos para diferenciar perfis entre expostos com e sem silicose daqueles não-expostos ocupacionalmente à sílica cristalina: (2.1) assinatura proteica em exossomos plasmáticos e (2.2) assinatura transcriptômica em sangue total; (3) estudos moleculares complementares em mineradores. (1) Os participantes foram divididos em: grupo 1 (n=44), agricultores com contato direto com agrotóxicos (diluição, preparo e aplicação no período da coleta), e grupo 2 (n = 68), agricultores sem contato direto no momento das coletas; sendo autodeclarados. A atividade da colinesterase não diferiu entre os grupos. As, Cr, Ni e V sanguíneos apresentaram concentrações acima dos valores aceitáveis e forte correlação entre eles, indicando fonte comum de exposição. O grupo 1 apresentou maior frequência de micronúcleos, buds, células binucleadas e outras alterações citotóxicas. A metilação global do DNA foi também mais elevada nesse grupo, correlacionando-se com Cr, Ni e Be. O comprimento dos telômeros correlacionou-se negativamente com idade, Cr e Ni. Os agricultores apresentaram danos genotóxicos, mutagênicos e epigenéticos. Em relação aos mineradores, (2.1) na primeira etapa, exossomos plasmáticos foram extraídos para análise proteômica. Os grupos incluíram não-expostos (CG, n=13), expostos sem silicose (SG I, n=18) e com silicose (SG II, n=17), classificados por radiografias segundo a Organização Internacional do Trabalho. A extração dos exossomos foi realizada por cromatografia de exclusão de tamanho, as proteínas analisadas por LC/MS-MS e os dados gerados analisados por recursos da bioinformática. Comparando-se o CG com SG I e SG II, as proteínas ACTC1, CFL1, RAC2, PFN 1 apresentaram diferença significativa entre os grupos, podendo ser consideradas promissores biomarcadores de exposição e/ou efeito à sílica cristalina. Na comparação entre SG I e SG II, apenas a proteína PZP apresentou diferença significativa, indicando potencial como biomarcador de 6 efeito da exposição à sílica cristalina (SC). A validação da PZP sérica foi realizada em novos grupos: não expostos (NOE, n = 21), expostos sem silicose (ECS, n = 19) e com silicose (MWS, n = 21). As concentrações séricas de PZP, analisadas por ELISA, foram significativamente maiores no grupo MWS em comparação ao ECS (p < 0,001) e ao NOE (p < 0,01). Esses resultados corroboram os achados proteômicos, indicando a PZP sérica como biomarcador de efeito da exposição à SC e possível preditor de silicose. Estudos com amostras maiores são necessários para confirmar a robustez desses resultados. (2.2) Adicionalmente, foi caracterizada a exposição no ambiente ocupacional à SC em duas minas e em amostradores individuais em mineradores, e demonstraram elevadas concentrações de sílica cristalina, até 8,3 vezes acima do limite estabelecido para a ACGIH. Também foi realizado o estudo do perfil transcriptômico de expostos com e sem silicose e não expostos ocupacionais e os dados demonstraram 17 genes diferencialmente expressos entre o grupo de mineradores sem e com silicose. (3) Na terceira etapa, os grupos incluíram não expostos (CG, n=13), expostos sem silicose (SG I, n=42) e com silicose (SG II, n=19). A excreção urinária de silício foi maior no CG do que nos mineradores, sugerindo retenção pulmonar da sílica nos expostos e menor distribuição e excreção. Foram observadas reduções na expressão gênica de TGF-β1 (SG II), na expressão proteica de PDL1 (linfócitos) e CD62P (monócitos) em ambos os grupos dos expostos, além de menor expressão de CD62L em monócitos no SG II. A mALB urinária estava aumentada no grupo SGII. Além disso, o SG I apresentou hipermetilação global do DNA, demonstrando alteração epigenética. Esses achados indicam alterações inflamatórias e epigenéticas associadas à exposição à SC. O estudo identificou alterações epigenéticas e genotóxicas em agricultores expostos a agentes carcinogênicos e, em mineradores expostos à SC, alterações moleculares com perfil inflamatório associado a doenças crônicas não transmissíveis. Abordagens ômicas revelaram assinaturas transcriptômicas e proteicas, além da validação de uma proteína como biomarcador de efeito da exposição à SC. Contudo, valores de referência ainda precisam ser definidos em diferentes níveis de exposição e em trabalhadores com desfechos patológicos.

Occupational exposure to chemical substances can induce pathophysiological alterations that promote the development of chronic noncommunicable diseases. Among the most affected groups are farmers, exposed to agrochemicals, and miners, exposed to crystalline silica (CS)—both carcinogenic and pro-fibrotic agents associated with cancer and silicosis. This study was divided into three main objectives: (1) To investigate the effects of agrochemical exposure on DNA damage and epigenetic alterations; (2) To perform omics studies to differentiate the profiles of individuals occupationally exposed to crystalline silica—with and without silicosis—from non-exposed individuals: (2.1) proteomic signature in plasma exosomes and (2.2) transcriptomic signature in whole blood; (3) To conduct complementary molecular studies in miners. (1) Participants were divided into two groups: Group 1 (n = 44), farmers with direct contact with pesticides (dilution, preparation, and application during sampling), and Group 2 (n = 68), farmers without direct contact at the time of sampling, all self-reported. Cholinesterase activity did not differ between groups. Blood levels of As, Cr, Ni, and V were above acceptable limits and strongly correlated with each other, suggesting a common exposure source. Group 1 showed higher frequencies of micronuclei, buds, binucleated cells, and other cytotoxic alterations. Global DNA methylation was also higher in this group, correlating with Cr, Ni, and Be levels. Telomere length correlated negatively with age, Cr, and Ni. Overall, farmers exhibited genotoxic, mutagenic, and epigenetic damage. (2.1) In the first stage of the miner study, plasma exosomes were extracted for proteomic analysis. Groups included non-exposed individuals (CG, n = 13), exposed without silicosis (SG I, n = 18), and exposed with silicosis (SG II, n = 17), classified according to the International Labour Organization radiographic criteria. Exosomes were extracted by size-exclusion chromatography, proteins were analyzed by LC/MS-MS, and data were processed using bioinformatics tools. When comparing CG with SG I and SG II, proteins ACTC1, CFL1, RAC2, and PFN1 showed significant differences among groups, suggesting potential as biomarkers of exposure and/or effect to crystalline silica. Comparing SG I and SG II, only the PZP protein differed significantly, indicating potential as an effect biomarker of exposure to crystalline silica (CS). Validation of serum PZP was performed in new groups: non-exposed (NOE, n = 21), exposed without silicosis (ECS, n = 19), and with silicosis (MWS, n = 21). Serum PZP concentrations, analyzed by ELISA, were significantly higher in MWS compared to ECS (p < 0.001) and NOE (p < 0.01). These results corroborate the proteomic findings, indicating serum PZP as an effect biomarker of exposure to CS and a possible predictor of silicosis. Larger studies are needed to confirm the robustness of these findings. (2.2) Additionally, occupational exposure to CS was characterized in two mines and through individual samplers in miners, showing crystalline silica concentrations up to 8.3 times above the ACGIH limit. Transcriptomic profiling of miners with and without silicosis and non-occupationally exposed individuals revealed 17 differentially expressed genes between miners without and with silicosis. (3) In the third stage, groups included non-exposed (CG, n = 13), exposed without silicosis (SG I, n = 42), and with silicosis (SG II, n = 19). Urinary silicon excretion was higher in CG than in miners, suggesting pulmonary silica retention in exposed individuals and reduced distribution and excretion. Reductions in TGF-β1 gene expression (SG II), PDL1 (lymphocytes), and CD62P (monocytes) protein expression were observed in both exposed groups, along with lower CD62L expression in monocytes in SG II. Urinary microalbumin levels were increased in SG II. Moreover, SG I showed global DNA hypermethylation, indicating epigenetic alteration. These findings suggest inflammatory and epigenetic changes associated with CS exposure. In summary, the study identified epigenetic and genotoxic alterations in farmers exposed to carcinogenic agents and molecular inflammatory profiles in miners exposed to CS, associated with chronic noncommunicable diseases. Omics approaches revealed transcriptomic and proteomic signatures and validated one protein as an effect biomarker of CS exposure. However, reference values must still be defined for different exposure levels and for workers with pathological outcomes.