Avaliação dos efeitos e do tratamento com Poly(I:C) sobre parâmetros astrogliais envolvidos na neuroinflamação

Abstract

O sistema nervoso central (SNC) é capaz de detectar e responder vigorosamente a invasões de patógenos, iniciando um processo chamado neuroinflamação que pode desempenhar um papel protetor (promove imunossupressão e reparo tecidual) através da resposta imunólogica das células gliais (astrócitos e microglia). Entretanto, uma disfunção nessa resposta de defesa, em particular uma exacerbação crônica, pode se tornar deletéria contribuindo assim para a progressão de uma variedade de distúrbios neurológicos. Especificamente, o ambiente inflamatório induzido por infecções virais provoca alterações que afetam a homeostase tecidual e as funções celulares do SNC, o que já foi documentado clínica e experimentalmente. Sequelas subagudas e crônicas foram observadas pós-infecção, o que pode ser tanto devido ao impacto imunológico a regiões ou células específicas, como pela presença persistente do material genético, como o RNA de fita dupla (ds-RNA), produto da replicação viral. Os receptores Toll-like (TLRs), também expressos por astrócitos, são importantes moduladores do sistema imunológico cerebral. Entre eles, o TLR3 é relatado como o mais expresso em astrócitos e é considerado um dos principais mediadores de resposta a infecções virais, devido a sua capacidade de reconhecer ds-RNA. Esse receptor possui um caráter único na sua via de sinalização, visto que envolve exclusivamente a via do adaptador contendo domínio TIR induzindo interferon-β (TRIF) dependente. A sua ativação culmina na expressão de fatores como o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) e a interleucina 1 beta (IL-1β), duas importantes citocinas pró-inflamatórias que tem a sua expressão regulada pela ativação do fator de transcrição nuclear κB (NF-kB). Os astrócitos exercem uma diversidade de funções essenciais do SNC, inclusive na neuroinflamação. Por isso, o objetivo desse trabalho foi avaliar o efeito da exposição ao Poly(I:C) (PIC), um ds-RNA sintético reconhecido pelo TLR3, sobre parâmetros astrocíticos e a via de sinalização inflamatória desse receptor. A fim de verificar a especificidade do insulto, usamos também o lipossacarídeo (LPS). Utilizando astrócitos primários, nós identificamos que após 24 h de exposição ao PIC (10 μg/mL, 25 μg/mL e 50 μg/mL) houve um aumento na expressão gênica do TLR3 e da subunidade ativada do NF-kB, diferentemente do LPS. Também observamos um aumento na transcrição da IL-1β e na secreção do TNF-α. Quanto a funcionalidade dos astrócitos, identificamos uma diminuição na atividade da glutamina sintetase (GS), enzima importante no metabolismo glutamatérgico, porém não vimos diferença no conteúdo de glutationa reduzida (GSH). O PIC também diminuiu a expressão gênica da S100B, inclusive com mais expressividade do que o LPS. Não encontramos alterações na viabilidade e integridade celular e não houve um efeito dose dependente em nenhum dos parâmetros analisados. Demonstramos assim, que a exposição ao PIC em um modelo in vitro de astrócitos é uma alternativa promissora para analisar os distintos contextos da neuroinflamação, visto que foi capaz de induzir um estado pró-inflamatório, modular a expressão do receptor associado à resposta de inflamação viral e alterar importantes marcadores de ativação dos astrócitos. Além de apresentar singularidades quando em comparação com o LPS, podendo representar assim um fenótipo reativo alternativo dos astrócitos.

The central nervous system (CNS) can detect and respond vigorously to pathogen invasion by initiating a process called neuroinflammation, which promotes immunosuppression and tissue repair through the immune response of glial cells (astrocytes and microglia). However, disruption of this defense response, particularly chronic exacerbation, can be detrimental, contributing to the progression of several neurological diseases. In particular, the inflammatory environment induced by viral infections causes changes that affect tissue homeostasis and CNS cellular function, which has been documented clinically and experimentally. Subacute and chronic sequelae have been observed after infection, which could be due to either the immunologic effects on specific regions or cells or the persistent presence of genetic material such as double-stranded RNA (ds-RNA), a product of viral replication. Toll-like receptors (TLRs) expressed by astrocytes are important modulators of this system. Among them, TLR3 is most abundantly expressed in astrocytes and is considered one of the major mediators of the response to viral infection because of its ability to recognize ds-RNA. This receptor has a unique character in it signaling pathway, as it exclusively involves the adaptor pathway containing the TIR domain that induces interferon-β (TRIF). Its activation leads to the expression of factors such as tumor necrosis factor alpha (TNF-α) and interleukin 1 beta (IL -1β), two important cytokines whose expression is controlled by the activation of nuclear transcription factor κB (NF -kB). Astrocytes exert a variety of important functions in the CNS, including neuroinflammation. Therefore, we decided to investigate the effects of exposure to poly(I:C) (PIC), a synthetic ds-RNA recognized by TLR3, on astrocytic parameters and the inflammatory signaling pathway of this receptor. To examine the specificity of the insult, we also used liposaccharide (LPS). Using primary astrocytes, we found that after 24-hour exposure to PIC (10 μg/mL, 25 μg/mL, and 50 μg/mL), there was an increase in gene expression of TLR3 and the activated subunit of NF-kB, in contrast to LPS. We also observed an increase in IL -1β transcription and TNF-α secretion. Regarding astrocyte functionality, we noted a decrease in the activity of glutamine synthetase (GS), an important enzyme in glutamatergic metabolism, but we saw no difference in the level of reduced glutathione (GSH). PIC also decreased S100B gene expression, even more than LPS. We did not detect any changes in cell viability and integrity, and there was no dose-dependent effect on any of the parameters studied. Thus, we show that exposure to PIC in an in vitro model of astrocytes is a promising alternative for the analysis of the neuroinflammatory process, since it was able to induce a pro-inflammatory state, modulate its receptor expression, and alter key activation markers of astrocytes. Moreover, it exhibits distinctive features compared to LPS and thus represents an alternative reactive phenotype.