Desenvolvimento de sistemas nanoestruturados contendo polieletrólitos para veiculação de peptídeos antimicrobianos

Abstract

O uso de peptídeos antimicrobianos naturais como compostos bioativos alimentares é uma alternativa viável para entrega de produtos seguros para consumo e de boa qualidade. O uso de nanoestruturas tem demonstrado potencial como carreadores de peptídeos antimicrobianos em alimentos, a fim de aumentar a vida útil de produtos com menor uso de conservantes químicos. Nanolipossomas contendo nisina e surfactina foram preparados por hidratação de filme, com fosfatidilcolina de soja e colesterol (PC), recobertos com os polieletrólitos catiônicos quitosana, maltodextrina e poli-L-lisina (PLL). Os nanolipossomas encapsulados apresentaram eficiência de encapsulação (EE) acima de 90%, baixo diâmetro médio das partículas e índice de polidispersão, com boa estabilidade durante um período de 60 dias sob refrigeração (4 °C). A encapsulação de nisina gerou uma EE de 88,94%, aumentando para (≥ 93,37%) quando se deu o uso de recobrimento com polieletrólitos. O diâmetro médio das nanoestruturas foi em torno de 100 nm, variando de 93 a 116 nm, com polidispersão entre 0,20 e 0,41, com visível aumento de tamanho após a incorporação dos polieletrólitos. O potencial zeta dos lipossomas encapsulados (com ou sem revestimento) foi de ±6,5 a ±32,7 mV. Em um segundo momento, as características térmicas dos nanolipossomas foram estudadas por análise termogravimétrica (TGA), onde as amostras foram submetidas a uma temperatura de (0 - 600 ºC) e por calorimetria exploratória diferencial (DSC), onde as amostras foram submetidas a ciclos de temperatura (-20 - 200 °C). Como resultado, foi observada a melhora da estabilidade térmica dos lipossomas recobertos por polieletrólitos, sendo a associação de nisina/quitosana o lipossoma que se destacou devido a menor degradação das nanoestruturas sob efeito da temperatura utilizada. Em um quarto momento, as mudanças estruturais foram avaliadas, por FTIR. Como resultado, foi observada a melhora da estabilidade térmica dos lipossomas recobertos por polieletrólitos, sendo a associação de nisina/quitosana o lipossoma que se destacou devido a menor degradação das nanoestruturas sob efeito da temperatura utilizada. Em um quarto momento, as mudanças estruturais foram avaliadas, por FTIR. Como resultado foi observada grande presença de picos predominantemente da fosfatidilcolina, o que já era esperado, devido sua majoritariedade na nanoestrutura. A presença de polieletrólitos na superfície dos lipossomas foi observada pelas interações intermoleculares entre estas substâncias, os fosfolipídios e a nisina, sendo percebidos a partir dos resultados das características físicas e térmicas. A atividade antimicrobiana foi avaliada em um quarto momento, avaliada contra três diferentes tipos de bactérias Gram-positivas (L. monocytogenes, S. aureus e B. cereus) e duas bactérias Gram-negativas (E. Coli e S. Enteritidis), em placas de ágar BHI, ágar leite integral e desnatado. A melhor atividade antimicrobiana foi encontrada para os lipossomas contendo nisina, contra L. monocytogenes, seguida de B. cereus, sendo possível visualizar a melhora da atividade na presença dos polieletrólitos catiônicos (de 3200 a 6400 UA.mL-1) destacando-se a quitosana, seguida da PLL e maltodextrina catiônica. O recobrimento de maltodextrina catiônica gerou atividade máxima testada para L. monocytogenes e B. Cereus, demosntrando a melhora da atividade com a presença do recobrimento no nanolipossoma. Nanoestruturas contendo surfactina apresentaram menor atividade antimicrobiana, contra todas as bactérias avaliadas, porém boa estabilidade durante o período de 30 dias. A PLL se destacou na encapsulação de surfactina, apresentando 400 UA.mL-1 na aplicação de E. Coli e S. Enteritidis. A atividade antimicrobiana foi mais eficiente quando aplicado em ágar leite, demonstrando resposta positiva para uso destas nanoestruturas em alimentos, gerando atividade máxima testada nos nanolipossomas contendo nisina com recobrimento de polieletrólitos quando aplicado contra as bactérias L. monocytogenes e B. cereus. Dentre os tipos de leite avaliados, o leite desnatado se destacou em alguns momentos com a melhora da atividade antimicrobiana, o que pode ser explicado pela composição do alimento. O recobrimento dos polieletrólitos catiônicos maltodextrina e PLL em nanolipossomas contendo nisina ou surfactina não foi relatado anteriormente. A surfactina encapsulada, agindo como antimicrobiano, em nanolipossomas alimentares é inovador neste trabalho e seus resultados são um ponto de partida para novas pesquisas. Portanto, pode-se observar que a encapsulação de nisina e surfactina em lipossomas recobertos com polieletrólitos catiônicos tem potencial para uso na liberação controlada de peptídeos antimicrobianos em alimentos, como o leite.

The use of natural antimicrobial peptides as food bioactive compounds is a viable alternative for delivering safe-to-consume and good quality products. The use of nanostructures has demonstrated potential as carriers of antimicrobial peptides in foods, to increase the shelf life of products with less use of chemical preservatives. Nanoliposomes containing nisin and surfactin were prepared by film hydration with soy phosphatidylcholine and cholesterol (PC), covered with the cationic polyelectrolytes chitosan, maltodextrin and poly-L-lysine (PLL). The encapsulated nanoliposomes showed encapsulation efficiency (EE) above 90%, low average particle diameter and polydispersity index, with good stability over a period of 60 days under refrigeration (4 °C). Nisin encapsulation generated an EE of 88.94%, increasing to (≥ 93.37%) when coating with polyelectrolytes was used. The average diameter of the nanostructures was around 100 nm, ranging from 93 to 116 nm, with polydispersity between 0.20 and 0.41, with a visible increase in size after incorporation of the polyelectrolytes. The zeta potential of the encapsulated liposomes (with or without coating) was ±6.5 to ±32.7 mV. In a second step, the thermal characteristics of the nanoliposomes were studied by thermogravimetric analysis (TGA), where the samples were subjected to a temperature of (0 - 600 ºC) and by differential scanning calorimetry (DSC), where the samples were subjected to cycles temperature (-20 - 200 °C). As a result, an improvement in the thermal stability of liposomes covered by polyelectrolytes was observed, with the nisin/chitosan association being the liposome that stood out due to less degradation of the nanostructures under the effect of the temperature used. In a fourth moment, the structural changes were evaluated by FTIR. As a result, a large presence of peaks predominantly from phosphatidylcholine was observed, which was already expected, due to its majority in the nanostructure. The presence of polyelectrolytes on the surface of the liposomes was observed by the intermolecular interactions between these substances, the phospholipids and nisin, being perceived from the results of the physical and thermal characteristics. The antimicrobial activity was evaluated in a fourth moment, evaluated against three different types of Grampositive bacteria (L. monocytogenes, S. aureus and B. cereus) and two Gram-negative bacteria (E. Coli and S. Enteritidis), in BHI agar plates, whole and skimmed milk agar. The best antimicrobial activity was found for liposomes containing nisin, against L. monocytogenes, followed by B. cereus, making it possible to visualize the improvement in activity in the presence of cationic polyelectrolytes (from 3200 to 6400 UA.mL-1), highlighting the chitosan, followed by PLL and cationic maltodextrin. The cationic maltodextrin coating generated maximum activity tested for L. monocytogenes and B. cereus, demonstrating the improvement in activity with the presence of the coating on the nanoliposome. Nanostructures containing surfactin showed lower antimicrobial activity against all bacteria evaluated, but good stability over a period of 30 days. PLL stood out in the encapsulation of surfactin, presenting 400 UA.mL-1 in the application of E. coli and S. Enteritidis. The antimicrobial activity was more efficient when applied to milk agar, demonstrating a positive response to the use of these nanostructures in foods, generating maximum activity tested in nanoliposomes containing nisin with polyelectrolyte coating when applied against the bacteria L. monocytogenes and B. cereus. Among the types of milk evaluated, skimmed milk stood out in some moments with improved antimicrobial activity, which can be explained by the composition of the food. Coating of the cationic polyelectrolytes’ maltodextrin and PLL onto nanoliposomes containing nisin or surfactin has not been previously reported. Encapsulated surfactin, acting as an antimicrobial, in food nanoliposomes is innovative in this work and its results are a starting point for new research. Therefore, the encapsulation of nisin and surfactin in liposomes covered with cationic polyelectrolytes has potential for use in the controlled release of antimicrobial peptides in foods, such as milk.