Efeito de pesticidas e de metais pesados na atividade de ectonucleotidases em sistema nervoso central de zebrafish (Danio rerio)

Abstract

Atualmente, considerando que nossa economia depende largamente de produtos industrializados e colheitas produtivas, dejetos industriais e agrícolas tornaram-se um grande problema para a saúde humana e do ambiente. A contaminação de efluentes hídricos por metais pesados e pesticidas tornaram-se inevitáveis e, conseqüentemente, efeitos adversos ocorrem em seres humanos, plantas e animais, onde um dos grupos mais atingidos são os peixes. O zebrafish (Danio rerio) é um modelo experimental consolidado em diversas áreas da ciência, como a neurociências e toxicologia. O genoma desta espécie já está quase todo seqüenciado e estudos demonstraram que muitos genes deste peixe são similares ao de mamíferos, incluindo a espécie humana. Evidências acumuladas por muitas décadas demonstram que nucleotídeos e nucleosídeos, principalmente o ATP e a adenosina exercem diversos efeitos sinalizadores no espaço extracelular. No sistema nervoso, o neurotransmissor ATP é armazenado de forma vesicular e liberado na fenda sináptica onde pode agir sobre receptores específicos localizados membrana celular, denominados receptores purinérgicos do tipo P2. Estes receptores são subdivididos em receptores ionotrópicos P2X e receptores metabotrópicos P2Y. A inativação do sinal mediado pelo ATP extracelular é mediada por uma família de enzimas denominadas ectonucleotidases. Entre este grupo de enzimas destacam-se a NTPDase (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) e a ecto-5'-nucleotidase. Após sofrer catabolismo pelas ectonucleotidases, o neurotransmissor ATP é hidrolisado ao neuromodulador adenosina. Este nucleosídeo exerce seus efeitos através dos receptores metabotrópicos denominados purinoceptores P 1. Estudos do nosso laboratório demonstraram a presença de ectonucleotidases como a NTPDase e a ecto-5' - nucleotidase no SNC de zebrafish. Além disso já foram citados na literatura que esta espécie apresenta purinoceptores do tipo P2X e P2Y. Neste estudo, nós investigamos o efeito in vitro e in vivo de metais pesados na atividade de ectonucleotidases em SNC de zebrafish. A exposição in vitro ao mercúrio inibiu a hidrólise de ATP, ADP de uma forma acompetitiva e a hidrólise do AMP de um modo não-competitivo. O chumbo inibiu in vitro a hidrólise somente do ATP de um modo acompetitivo. A exposição in vivo ao mercúrio ou chumbo (20 μg/L, por 24h, 96h ou 30 dias) causou um efeito diferencial na hidrólise dos nucleotídeos. A exposição ao mercúrio durante 96h causou uma inibição significativa na hidrólise do ATP, ADP e AMP. lnteressantemente, após 30 dias de exposição ao mercúrio a hidrólise do ATP voltou aos níveis do controle, a hidrólise do ADP aumentou, e a hidrólise do AMP continuou inibida, quando comparada ao controle. Após a exposição ao chumbo durante 96h, apenas a hidrólise do ATP foi inibida. Após a exposição crônica durante 30 dias ao chumbo, uma inibição significativa na hidrólise de ATP, ADP e AMP foi observada. Nós também investigamos o efeito de carbamatos e organofosforados sobre as atividades ectonucleotidásicas em SNC de zebrafish. Após a exposição in vivo ao carbofuran por sete dias na concentração 50 e 500 μg/L, foi observada uma diminuição significativa somente na hidrólise de ADP em ambas concentrações testadas. O malathion, na concentração de 500 μg/L, foi capaz de inibir a hidrólise de ADP e AMP. Para verificar se o carbofuran e o malathion agem diretamente nas enzimas, foram realizados experimentos in vitro com estes pesticidas. O carbofuran e o malathion inibiram a hidrólise de ATP e ADP, mas não tiveram efeito na hidrólise de AMP. O carbofuran inibiu a hidrólise do ATP e ADP de uma forma acompetitiva. O malathion inibiu a hidrólise do ATP de uma forma não competitiva e a hidrólise do ADP de uma forma acompetitiva. Nossos resultados demonstram que tanto metais pesados quanto pesticidas afetam a atividade das ectonucleotidases em SNC de zebrafish, sugerindo que o sistema purinérgico pode ser um alvo relacionado à neurotoxicidade destes contaminantes ambientais.

Currently, considering that our economy depends on industrialized products and productive harvests, industriais and agricultura! dejects have become a relevant problem for human and environmental health. The contamination of hidric effluents by heavy metais and pesticides has become eminent and, consequently, adverse effects are inevitable in humans, plants and animais, which fish are one of the most affected groups. Zebrafish (Danio rerio) is a consolidated model system in many research areas, including neuroscience and toxicology. The genome of this specie is almost sequenced and studies have shown that many genes of this specie are similar to mammals, including the human specie. Evidence has shown that nucleotides and nucleosides, mainly ATP and adenosine, exert extracellular signaling effects. ln the nervous system, the neurotransmitter ATP is stored in vesicles and released in the synaptic cleft, where can act on specific cellular membrane receptors called purinergic P2 receptors. These receptors are subdivided on ionotropic P2X receptors and metabotropic P2Y receptors. The inactivation of ATP extracellular signaling is mediated by a family of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes NTPDase (nucleoside triphosphate diphosphohydrolase) and ecto-5'-nucleotidase. After the catabolism promoted by ectonucleotidases, the neurotransmitter ATP is hydrolyzed to the neuromodulator adenosine. This nucleoside exerts its effects by the activation of P 1 metabotropic receptors. Studies from our laboratory have demonstrated the presence of NTPDase and ecto-5'-nucleotidase in CNS of zebrafish. Furthermore, P2X and P2Y purinoceptors already are described in this specie. Here we investigated the in vitro and in vivo effect of heavy metals on ectonucleotidases in CNS of zebrafish. The in vitro exposure to mercury inhibited ATP and ADP hydrolysis by an uncompetitive manner and AMP hydrolysis by noncompetitive manner. Lead inhibited only the in vitro ATP hydrolysis by a uncompetitive manner. Jn vivo exposure to mercury and lead (20 μg/L, for 24h, 96h or30 days) caused a differential effect on nucleotide hydrolysis. Mercury exposure during 96h caused a significant inhibition on ATP, ADP and AMP hydrolysis. Interestingly, after 30 days of mercury exposure, the A TP hydrolysis returned to control levels, ADP hydrolysis strongly increased and AMP hydrolysis remaining inhibited, when compared to control group. After 96h of lead exposure, only the ATP hydrolysis was inhibited. After the chronic lead exposure during 30 days, a significant inhibition in ATP, ADP and AMP was observed. We also investigated the effect of carbamates and organophosphate pesticides on ectonucleotidase activities in CNS of zebrafish. After the in vivo exposure to carbofuran during seven days to 50 and 500 μg/L, only an inhibition of ADP hydrolysis was observed in both concentrations tested. Malathion, in the concentration of 500 μg/L, was able to inhibit ADP and AMP hydrolysis. ln order to verify if carbofuran and malathion act directly in the enzymes, in vitro experiments were performed with the pesticides. Carbofuran and malathion inhibited ATP and ADP hydrolysis, but no effect on AMP hydrolysis was observed. Carbofuran inhibited ATP and ADP by an uncompetitive manner. Malathion inhibited ATP hydrolysis by a competitive manner and ADP hydrolysis by an uncompetitive manner. Our results have shown that heavy metais and pesticides affect the ectonucleotidase activities in CNS of zebrafish, suggesting that the purinergic system can be a target related to the neurotoxic effects of these environmental contaminants.