Padronização da co-cultura de Trichomonas vaginalis, Candida albicans e Lactobacillus crispatus : um novo método para caracterização da atividade antimicrobiana

Abstract

Disbiose é o desequilíbrio na microbiota vaginal, normalmente dominada por Lactobacillus. As principais causas são vaginose, vaginite e infecções sexualmente transmitidas (ISTs). Embora em baixa quantidade, há uma comunidade fúngica presente na microbiota vaginal das mulheres, sendo Candida albicans a levedura mais predominante. No entanto, esta levedura pode causar vaginite infecciosa, conhecida como candidíase vulvovaginal (CVV), que está associada a casos recorrentes. A IST não viral mais comum do mundo é a tricomoníase, causada pelo protozoário flagelado extracelular Trichomonas vaginalis. Essa infecção está associada ao aumento da transmissão e aquisição de HIV/AIDS. Ambas, tricomoníase e CVV, apresentam isolados resistentes ao tratamento, destacando a necessidade de novos fármacos. Neste contexto, esta dissertação teve como objetivo padronizar a co-cultura de T. vaginalis, C. albicans e L. crispatus a fim de simular o microambiente vaginal, funcionando como uma ferramenta de testagem de compostos ativos almejando novos fármacos. Neste contexto, esta dissertação teve como objetivo padronizar a co-cultura de T. vaginalis, C. albicans e L. crispatus a fim de simular o microambiente vaginal, funcionando como uma ferramenta de testagem de compostos ativos almejando novos fármacos. O meio de cultura selecionado foi o meio líquido de De Man, Rogosa e Sharpe (MRS) e a densidade inicial de isolados ATCC ou clínico fresco de T. vaginalis, C. albicans e L. crispatus foi de 1,00 x 106 trofozoítos/mL, 3,33 x 104 UFC/mL e 5,53 x 106 UFC/mL (LC2, co- cultura com o isolado ATCC) ou 5,53 x 107 UFC/mL (LC1, co-cultura com o isolado clínico fresco), respectivamente. O meio MRS e densidade inicial escolhidos promoveram, após 24 horas de incubação, um pH próximo a 5,0 e uma média de densidade de 2,0 x 106 trofozoítos/mL para os isolados de T. vaginalis, 2,6 x 106 UFC/mL para C. albicans e 7,9 x 106 UFC/mL para LC2 e 8,3 x 106 UFC/mL para LC1. Com a padronização, observou-se que maiores densidades de L. crispatus influenciaram na viabilidade celular de C. albicans e do isolado ATCC de T. vaginalis. Os valores de MIC para metronidazol de isolados de T. vaginalis e MFC para fluconazol de C. albicans reduziram (2 vezes para o isolado ATCC e 4 vezes para o isolado clínico) na co-cultura quando comparados com a monocultura. Além disso, a co-cultura aumentou a citotoxicidade do isolado ATCC, inibiu a formação de biofilme e a atividade metabólica do biofilme de C. albicans (em até 92% e 90%, respectivamente) e a transição de levedura para hifa de C. albicans (em até 70%). Este conjunto de resultados sugere que este sistema in vitro é um método eficiente para avaliar a eficácia antimicrobiana de novos compostos contra patógenos da vaginite e para avaliar interações entre microrganismos.

Dysbiosis is an imbalance in the vaginal microbiota, typically dominated by Lactobacillus. It is commonly caused by bacterial vaginosis, vaginitis, and sexually transmitted infections (STIs). Although in low quantities, a fungal community, with Candida albicans being the most predominant yeast, is found in the vaginal microbiota of women. However, this yeast can cause infectious vaginitis, known as vulvovaginal candidiasis (VVC), which often recurs. The most common non-viral STI globally is trichomoniasis, caused by the extracellular flagellated protozoan Trichomonas vaginalis. This infection is associated with an increased risk of HIV/AIDS transmission and acquisition. Both trichomoniasis and VVC exhibit treatment-resistant isolates, emphasizing the need for new therapies. In this context, this dissertation aimed to standardize the co-culture of T. vaginalis, C. albicans, and L. crispatus to mimic the vaginal microenvironment, serving as a system for testing active compounds to develop new drugs. The chosen culture medium was de Man, Rogosa, and Sharpe (MRS) liquid medium, with an initial density of ATCC or fresh clinical isolates of T. vaginalis, C. albicans, and L. crispatus set at 1.00 x 106 trophozoites/mL, 3.33 x 104 CFU/mL, and 5.53 x 106 CFU/mL (LC2, co-culture with the ATCC isolate) or 5.53 x 107 CFU/mL (LC1, co-culture with the fresh clinical isolate), respectively. The selected MRS medium and initial density yielded a pH close 5.0 and an average density of 2.00 x 106 trophozoites/mL for T. vaginalis isolates, 2.6 x 106 CFU/mL for C. albicans, and 7.9 x 106 CFU/mL for LC2 and 8.3x106 CFU/mL for LC1 after 24 hours of incubation. Standardization revealed that higher densities of L. crispatus influenced the cell viability of C. albicans and the ATCC isolate of T. vaginalis. MIC values for metronidazole of T. vaginalis isolates and MFC values for fluconazole of C. albicans decreased (2 times for the ATCC isolate and 4 times for the clinical isolate) in co-culture compared to monoculture. Additionally, co-culture increased the cytotoxicity of the ATCC isolate, inhibited biofilm formation (up to 92%), and reduced its metabolic viability of C. albicans (up to 90%), as well as the yeast-to-hyphal transition of C. albicans (up to 70%). These results suggest that this in vitro system is an effective method for evaluating the antimicrobial efficacy of new compounds against pathogens causing vaginitis and for studying interactions between microorganisms.