Aspectos genéticos da homocistinúria clássica no Brasil : caracterização de haplótipos e de variantes

Abstract

Introdução: Os erros inatos do metabolismo (EIM) são distúrbios genéticos raros causados por defeitos na atividade enzimática ou em transportadores, e que resultam em manifestações clínicas sistêmicas. A Homocistinúria Clássica é um erro inato do metabolismo, de herança autossômica recessiva, na qual há um déficit da enzima cistationina-beta-sintase (CBS) e elevação dos níveis plasmáticos da homocisteína e da metionina e diminuição dos níveis de cisteína. Estima-se que sua prevalência mundial seja de aproximadamente 0,38:100.000 indivíduos. As principais manifestações clínicas são ectopia lentis, osteoporose e tromboembolismo. Seu tratamento é realizado através da administração de piridoxina (vitamina B6) e de dieta restrita na ingestão de metionina e com suplementação de aminoácidos essenciais. O gene que codifica a cistationina-beta-sintase, CBS, localiza-se no cromossomo 21q22.3 e apresenta grande heterogeneidade alélica. De acordo com nosso grupo, a variante patogênica p.Trp323Ter (c.969G>A), inicialmente descrita na Arábia Saudita, foi previamente relatada em pacientes oriundos da região nordeste (Retirolândia – Bahia) com uma frequencia alélica de 11,3%, sugerindo um possível efeito fundador da variante no Brasil. Objetivo Geral: Caracterizar aspectos genéticos da Homocistinúria Clássica no Brasil. Objetivos Específicos: 1) Investigar a possível origem única da variante p.Trp323Ter no gene CBS em pacientes brasileiros; 2) Determinar o genótipo de uma amostra de pacientes brasileiros com Homocistinúria Clássica. Métodos: Para o cumprimeto do objetivo específico 1: Foram incluídos 10 pacientes (sexo masculino: 6; média de idade 18,7 anos) com diagnóstico molecular de Homocistinúria Clássica e presença em homozigose da variante patogênica p.Trp323Ter, da região nordeste do Brasil. Os dados clínicos de diagnóstico, manifestações clínicas e antropométricos foram pesquisados em prontuários e fichas clínicas. Foram utilizadas amostras de DNA de sangue periférico, amplificadas por PCR e analisadas por sequenciamento de Sanger. Seis marcadores intragênicos (gene CBS) foram sequenciados pelo método de Sanger: c.844_845ins68; c.1080C>T; g.13514G>A; g.13617A>G; g.13715C>T; g.13800G>A; Para o cumprimeto do objetivo específico 2: Foi analisada uma coorte de 20 pacientes brasileiros com Homocistinúria Clássica (sexo feminino: 13) de três regiões brasileiras (Nordeste, Sudeste e Sul). Os dados de diagnóstico e manifestações clínicas foram pesquisados em prontuários e fichas clínicas. As amostras de DNA foram extraídas, amplificadas por PCR convencional para os éxons 1-16, purificadas e analisadas por sequenciamento de Sanger. Novas variantes foram classificadas de acordo com as diretrizes da American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) e avaliadas para patogenicidade através de mapas funcionais gerados por ensaio de complementação de alto rendimento em leveduras. Resultados: Objetivo específico 1: a média de idade de início dos sintomas foi de 3,9 anos, e todos eram não resposivos à piridoxina. Dentre as manifestações clínicas, 10/10 pacientes apresentaram comprometimento ocular, 8/10 déficit cognitivo, 8/10 alterações ósseas, e 5/10 eventos tromboembólicos prévios. A mediana nos níveis de homocisteína total foi de 157,5 μmol/L e de metionina foi de 199,9 μmol. Apenas um haplótipo (H1: -CGACG) foi encontrado. Objetivo específico 2: a média de idade do início dos sintomas foi de 6,3 anos. Os indivíduos eram de 16 famílias (consanguinidade foi relatada em 2 famílias), de três regiões do Brasil, 70% foram classificados como não-responsivos à piridoxina. Dentre as manifestações clínicas, 18 (94,7%) pacientes apresentaram comprometimento ocular, 11 (57,8%) apresentaram algum sintoma relacionado ao SNC, 9 (47,3%) apresentaram alterações ósseas e 5 (26,3%) complicações vasculares. A mediana nos níveis de homocisteína total e de metionina para pacientes responsivos foi de 50 μmol/L e 136 μmol, e para pacientes não-responsivos foi de 204,8 μmol/L e 393,8 μmol. Foram encontradas 14 variantes diferentes, sendo três inéditas (p.Asp129Gly, p.Gly351Asp e p.Val533Gly). As variantes mais frequentes foram p.Trp323Ter (23,3%), p.Ile278Thr (13,3%), e p.Thr353Met (10%). Conclusão: A variante p.Trp323Ter parece estar associada a um fenótipo clínico e bioquímico grave, e ser frequente no Brasil. A sua alta frequência e a presença de apenas um haplótipo é provavelmente resultado de um efeito fundador. A determinação do genótipo de novos pacientes e caracterização clínica, sugere um perfil clínico e genético muito particular da Homocistinúria Clássica no Brasil. Além disso, o estudo encontrou três novas variantes de importância para a doença (p.Asp129Gly, p.Gly351Asp e p.Val533Gly).

Background: Inborn errors of metabolism (IEM) are rare genetic disorders caused by defects in enzymatic activity or transporters, which result in systemic manifestations. Classical Homocystinuria is an inborn error of metabolism, of autosomal recessive inheritance, in which there is a deficit of the enzyme cystathionine-beta-synthase (CBS) and elevation of plasmatic levels of homocysteine and methionine and decrease of cysteine levels. Its worldwide prevalence is estimated to be approximately 0.38:100,000 individuals. The main clinical manifestations are subluxated lens, osteoporosis and thromboembolism. Its treatment is carried out through the administration of pyridoxine (vitamin B6) and a diet restricted in the intake of methionine and supplementation of essential amino acids. The gene that encodes cystathionine-beta-synthase, CBS, is located on chromosome 21 (21q22.3) and presents great allelic heterogeneity. According to our group, the pathogenic variant p.Trp323Ter (c.969G>A), initially described in Saudi Arabia, was previously reported in patients from the Northeast region (Retirolândia – Bahia) with an allelic frequency of 11.3%, suggesting a possible founder effect of variant in Brazil. General Objective: To characterize genetic aspects of Classical Homocystinuria in Brazil. Specific Objectives: 1) Investigate the possible unique origin of the p.Trp323Ter variant in the CBS gene in Brazilian patients; 2) Determine the genotype of a sample of Brazilian patients with Classical Homocystinuria. Methods: To achieve specific objective 1: 10 patients were included (male sex: 6; mean age 18.7 years old) with a molecular diagnosis of Classical Homocystinuria and the homozygous presence of the pathogenic variant p.Trp323Ter, from the northeast region of Brazil. Clinical diagnostic data, clinical manifestations and anthropometric data were researched in medical records and clinical records. Peripheral blood DNA samples were used, amplified by PCR and analyzed by Sanger sequencing. Six intragenic markers (CBS gene) were sequenced by the Sanger method: c.844_845ins68; c.1080C>T; g.13514G>A; g.13617A>G; g.13715C>T; g.13800G>A; To achieve specific objective 2: A cohort of 20 Brazilian patients with Classical Homocystinuria (female sex: 13) was analyzed, from three Brazilian regions (Northeast, Southeast and South). Diagnostic data and clinical manifestations were searched in medical records and clinical records. DNA samples were extracted, amplified by conventional PCR for exons 1-16, purified and analyzed by Sanger sequencing. Novel variants were classified according to the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) guidelines and evaluated for pathogenicity through functional maps generated by high-throughput complementation assay in yeast. Results: Specific objective 1: the average age at onset of symptoms was 3.9 years old, and all were non-responsive to pyridoxine. Among the clinical manifestations, 10/10 patients presented ocular involvement, 8/10 cognitive deficit, 8/10 bone changes, and 5/10 previous thromboembolic events. The median total homocysteine levels were 157.5 μmol/L and methionine levels were 199.9 μmol. Only one haplotype (H1: -CGACG) was found. Specific objective 2: the average age at symptom onset was 6.3 years old. The individuals were from 16 families (consanguinity was reported in 2 families), from three regions of Brazil, 70% were classified as non-responsive to pyridoxine. Among the clinical manifestations, 18 (94.7%) patients presented ocular involvement, 11 (57.8%) presented symptom related to the CNS, 9 (47.3%) presented bone changes and 5 (26.3%) vascular complications. The median total homocysteine and methionine levels for responsive patients were 50 μmol/L and 136 μmol, and for non-responsive patients it was 204.8 μmol/L and 393.8 μmol. 14 different variants were found, three of which were novel (p.Asp129Gly, p.Gly351Asp and p.Val533Gly). The most frequent variants were p.Trp323Ter (23.3%), p.Ile278Thr (13.3%) and p.Thr353Met (10%). Conclusion: The p.Trp323Ter variant appears to be associated with severe clinical and biochemical phenotype, and to be common in Brazil. Its high frequency and the presence of only one haplotype is probably the result of a founder effect. The determination of the genotype of novel patients and clinical characterization suggests a very particular clinical and genetic profile of Classical Homocystinuria in Brazil. Furthermore, the study found three novel variants of importance for the disease (p.Asp129Gly, p.Gly351Asp and p.Val533Gly).