Nanocápsulas multiparede carregadas com etoposido e funcionalizadas com diferentes estratégias para a terapia direcionada ao adenocarcinoma de pulmão

Abstract

O câncer de pulmão é o tipo de câncer mais comum e a principal causa de mortes relacionada ao câncer em todo o mundo. O etoposido (ETO), um inibidor da topoisomerase II, é um dos fármacos utilizados para a terapia do câncer de pulmão. No entanto, este fármaco apresenta baixa solubilidade aquosa e toxicidade inespecífica, ocasionando graves efeitos adversos sistêmicos e limitando sua eficácia terapêutica. A nanoencapsulação do etoposido pode ser uma alternativa para solucionar estas limitações. Além disso, a modificação da superfície das nanopartículas com estratégias visando os receptores do fator de crescimento epidérmico tipo 1 (EGFR) pode proporcionar um maior direcionamento e acúmulo em células tumorais de pulmão que superexpressam este receptor. Primeiramente, realizamos um levantamento bibliográfico sobre nanopartículas orgânicas com superfície modificada para a terapia direcionada ao câncer de pulmão. Essa pesquisa resultou na elaboração de um artigo de revisão que contempla detalhes importantes sobre os mecanismos de direcionamento às células tumorais, as principais técnicas para funcionalização da superfície, incluindo ligações covalentes e não-covalentes, e os alvos e receptores de maior interesse no câncer de pulmão. Posteriormente, desenvolvemos nanocápsulas de núcleo-lipídico contendo etoposido (NC ETO), revestidas com quitosana (NC ETO Q) e funcionalizadas com anfirregulina (AREG), fator de crescimento epidérmico (EGF), erlotinibe (ERL) ou fator de crescimento transformador-alfa (TGF-α) (NC ETO Q AREG, NC ETO Q EGF, NC ETO Q ERL e NC ETO Q TGF-α, respectivamente), e avaliamos o potencial citotóxico em células de adenocarcinoma de pulmão, resultando em dois artigos científicos experimentais. NC ETO foram desenvolvidas pela primeira vez, empregando a técnica de deposição interfacial do polímero pré-formado, e apresentaram distribuição homogênea de diâmetro médio (~150 nm), elevado teor de etoposido (~100%) e eficiência de encapsulação (~100%), estabilidade físico-química (28 dias sob refrigeração) e perfil de liberação biexponencial (~70% em 72 horas). Após o revestimento com quitosana e a funcionalização da superfície, obtidos através de reações interfaciais, houve um aumento do diâmetro médio (~175 nm), a distribuição manteve-se unimodal, inversão do potencial zeta (+12 mV), e as taxas de teor de etoposido (>95%) e eficiência de encapsulação (>90%) mantiveram-se elevadas. A citotoxicidade dos tratamentos foi avaliada, primeiramente, empregando método colorimétrico (ensaio MTT) em células de adenocarcinoma de pulmão (A549), onde observamos que em concentrações superiores à 3×1011 partículas/mL a redução da viabilidade celular está relacionada a partícula per se. Por isso, uma concentração inferior de partículas, equivalente à 10 μmol de etoposido, foi selecionada para dar continuidade nos experimentos. Comparando etoposido em solução (ETO) e NC ETO (antes da modificação da superfície), houve uma redução da viabilidade celular 3x superior após 48h de exposição à nanocápsula. Comparando a nanocápsula etoposido revestida não-funcionalizada (NC ETO Q) e as nanocápsulas etoposido revestidas e funcionalizadas, após exposição de 48h aos tratamentos, um aumento significativo da citotoxicidade foi observado com a NC ETO Q ERL. Também avaliamos a captação das nanocápsulas funcionalizadas por células A549, onde foi observado que após a funcionalização houve aumento significativo da internalização das nanocápsulas, provavelmente via endocitose mediada por receptor, neste caso EGFR. Posteriormente, as células A549 foram transduzidas com 53BP1-mApple, uma proteína fluorescente de marcação de dano nuclear, e acompanhadas em tempo real, durante 20 dias, utilizando uma plataforma automatizada (Incucyte®) de rastreamento de células vivas. As células foram analisadas quanto ao número de células vivas, morfologia, área nuclear e número de danos (focis de 53BP1). Para isso, utilizamos um script de programação em Phyton que permitiu realizar a quantificação da fluorescência nas células únicas transduzidas com 53BP1-mApple. Comparando ETO e NC ETO (antes da modificação da superfície), observamos que a nanocápsula promoveu danos nucleares significativos a longo prazo (20 dias), aumentando consequentemente a indução da senescência (caracterizada por uma maior área nuclear) e reduzindo significativamente a subpopulação proliferativa em comparação com o etoposido em solução. Após a modificação da superfície, foi verificada uma melhoria dos efeitos a longo prazo induzidos pela nanoencapsulação do etoposido, com a NC ETO Q AREG exibindo os maiores índices de senescência e dano nuclear, seguida da NC ETO Q ERL, NC ETO Q EGF, NC ETO Q TGFα, NC ETO Q, e ETO. Por fim, nossos resultados destacam a superioridade da nanoencapsulação, particularmente com funcionalização da superfície, no aumento dos efeitos citotóxicos a longo prazo e indução de senescência do etoposídeo em células de câncer de pulmão, sendo uma estratégia inovadora para superar as limitações deste tratamento e encorajando fortemente futuras investigações.

Lung cancer is the most common type of cancer and the leading cause of cancer-related deaths worldwide. Etoposide (ETO), a topoisomerase II inhibitor, is one of the treatments used in lung cancer therapy. However, this drug has low aqueous solubility and nonspecific toxicity, which can cause serious systemic adverse effects and limit its therapeutic efficacy. Nanoencapsulation of etoposide may provide an alternative approach to overcoming these limitations. Moreover, surface modification of nanoparticles with strategies targeting the epidermal growth factor receptor type 1 (EGFR) may enhance targeting and accumulation in lung tumor cells that overexpress this receptor. First, we conducted a literature review on surface-modified organic nanoparticles for targeted lung cancer therapy. This research culminated in the preparation of a review article that details the mechanisms of tumor cell targeting, the main techniques for surface functionalization, including covalent and non-covalent bonds, and the most relevant targets and receptors in lung cancer. Subsequently, we developed lipid-core nanocapsules containing etoposide (NC ETO), coated with chitosan (NC ETO C), and functionalized with amphiregulin (AREG), epidermal growth factor (EGF), erlotinib (ERL), or transforming growth factor-alpha (TGF-α) (NC ETO C AREG, NC ETO C EGF, NC ETO C ERL, and NC ETO C TGF-α, respectively), and evaluated their cytotoxic potential in lung adenocarcinoma cells, resulting in two experimental scientific articles. NC ETO were developed for the first time using the interfacial deposition technique of a preformed polymer, resulting in a homogeneous distribution of average diameter (~150 nm), high etoposide content (~100%) and encapsulation efficiency (~100%), physical-chemical stability (28 days under refrigeration), and a biexponential release profile (~70% over 72 hours). After coating with chitosan and functionalizing the surface, achieved through interfacial reactions, there was an increase in the mean diameter (~175 nm), the distribution remained unimodal, inversion of the zeta potential (+12 mV), and the etoposide content (>95%) and encapsulation efficiency (>90%) remained high. The cytotoxicity of the treatments was initially evaluated using a colorimetric method (MTT assay) in lung adenocarcinoma cells (A549), where we observed that at concentrations higher than 3×1011 particles/mL, the reduction in cell viability was related to the particles per se. Therefore, a lower particle concentration, equivalent to 10 μmol of etoposide, was selected for further experiments. Comparing etoposide in solution (ETO) and NC ETO (before surface modification), we observed a threefold greater reduction in cell viability after 48 hours of exposure to the nanocapsules. Comparing the non-functionalized and the coated (NC ETO C) and functionalized etoposide nanocapsules, a significant increase in cytotoxicity was observed with NC ETO C ERL after 48 hours of exposure. We also evaluated the uptake of functionalized nanocapsules by A549 cells, where it was observed that functionalization significantly increased nanocapsule internalization, likely via receptor-mediated endocytosis, specifically through EGFR. A549 cells were then transduced with 53BP1-mApple, a fluorescent protein that marks nuclear damage, and monitored in real time for 20 days using an automated live cell tracking platform (Incucyte®). Cells were analyzed for number of live cells, morphology, nuclear area, and number of damages (53BP1 foci). A Python programming script was used to quantify fluorescence in single cells transduced with 53BP1-mApple. Comparing ETO and NC ETO (before surface modification), we observed that the nanocapsules promoted significant nuclear damage over the long term (20 days), which consequently increased senescence induction (characterized by a larger nuclear area) and significantly reduced the proliferative subpopulation compared to etoposide in solution. After surface modification, an enhancement in the long-term effects induced by nanoencapsulation of etoposide was observed, with NC ETO C AREG showing the highest rates of senescence and nuclear damage, followed by NC ETO C ERL, NC ETO C EGF, NC ETO C TGF-α, NC ETO C, and ETO. In conclusion, our results highlight the superiority of nanoencapsulation, particularly with surface functionalization, in enhancing the long-term cytotoxic effects and senescence induction of etoposide in lung cancer cells, presenting an innovative strategy to overcome the limitations of this treatment and strongly encouraging future investigations.