Galleria mellonella como modelo de infecção para o estudo da patogenicidade de Escherichia coli patogênica aviária (APEC)

Abstract

A colibacilose é causada por um grupo de bactérias denominado Escherichia coli patogênica aviária (APEC). Dependendo da virulência das cepas, da condição de saúde do hospedeiro e da presença e tipo de fatores predisponentes, a infecção se manifesta como uma septicemia inicial, seguida por morte súbita ou inflamação localizada em múltiplos órgãos. Técnicas moleculares identificaram alguns genes-chave de virulência APEC, mas estes não ocorrem universalmente nos isolados. A diversidade fenotípica e genotípica sugere a presença de múltiplos mecanismos mediando a patogenicidade. Pesquisas sobre a patogênese ainda requerem o uso de animais em modelos de infecção para reproduzir a doença. Devido a questões de custos, conflitos éticos e tempo de execução, recentemente tem sido proposto o uso do inseto Galleria mellonella como hospedeiro em ensaios in vivo. Estudos já demonstraram haver correlação entre o modelo Galleria e modelos bem estabelecidos de vertebrados. Dentro deste contexto, procurou-se determinar a viabilidade e a reprodutibilidade do uso de larvas de G. mellonella na caracterização da patogenicidade de isolados APEC. Para isso, variáveis de resposta do inseto foram aferidas e correlacionadas (coeficiente de correlação de Spearman, ρ) com o índice de patogenicidade (IP, 0-10) das APEC determinado em aves (pintos de um dia de idade). Inoculações preliminares serviram para padronização do peso ideal das larvas (260-320mg), tempo total de observação pós-inoculação (72h) e dose letal para 50% das larvas (DL50, média de 105 UFC/larva). Três ensaios de infecção independentes foram realizados (n= 40 amostras APEC). As larvas inoculadas (10 larvas/cepa) foram monitoradas a cada 12 horas, revelando os dados dos seguintes parâmetros: taxa de mortalidade (%), DL50, curvas de sobrevivência, melanização in vitro (hemolinfa) e visual (sem/mínima, média e máxima), densidade celular (hemócitos/mL), lesão celular (enzima lactato desidrogenase, LDH) e escore de doença larval (0-10). Os experimentos de inoculação demonstraram que as larvas de G. mellonella foram susceptíveis à infecção por APEC, sendo a mortalidade dose-dependente. Além da baixa correlação com o IP, as variáveis densidade celular e LDH não apresentaram poder de discriminação de virulência entre cepas. A melanização in vitro demonstrou correlação forte (ρ de 0,731) com o IP, porém a análise utilizou dados de apenas 15 isolados APEC. As variáveis DL50, taxa de mortalidade e melanização visual (corpo da larva) apresentaram associação fraca (ρ de -0,422, 0,450 e 0,456, respectivamente) com o IP. O parâmetro que melhor caracterizou a patogenicidade das cepas APEC foi o escore de doença larval, possivelmente por somar os efeitos de quatro variáveis (mortalidade, melanização, formação de casulo e atividade). A correlação com o IP foi moderada (ρ de 0,558), mas estatisticamente significativa (p≤0,05). As curvas de sobrevivência se revelaram úteis na análise comparativa entre os perfis de mortalidade provocados pelas cepas APEC de baixa (IP≤1,99), intermediária (IP 2 a 4,99) e alta patogenicidade (IP≥5). Os dados gerados no presente trabalho sustentam a indicação do modelo de infecção com larvas de G. mellonella como uma metodologia válida para a determinação da patogenicidade de isolados APEC. O modelo se mostrou assertivo na caracterização de cepas com virulência bem definida (apatogênicas e de alta patogencidade).

Avian colibacillosis is caused by a group of bacteria called avian pathogenic Escherichia coli (APEC). The infection generally manifests as an initial septicemia that is followed by sudden death or localized inflammation in multiple organs; however, this is highly dependent on the virulence of the strain, host status, and presence and type of predisposing factors. Molecular techniques have been used to identify some key APEC virulence genes, but these do not occur universally in all isolates. The phenotypic and genotypic diversity suggests the presence of multiple mechanisms that mediate pathogenicity. Pathogenesis research still requires the use of animals in infection models to replicate the disease condition. Owing to cost issues, ethical considerations and execution time, the use of the insect Galleria mellonella as a host in in vivo assays has recently been proposed. Studies have already demonstrated a correlation between the Galleria model and well-established vertebrate models. Thereby, the present study aimed to determine the viability and reproducibility of using G. mellonella larvae to characterize the pathogenicity of APEC isolates. For this, insect response variables were measured and correlated (Spearman's correlation coefficient, ρ) with the pathogenicity index (PI, 0–10) of APEC determined in day-old chicks. Preliminary inoculations were used to standardize the ideal weight of the larvae (260–320 mg), total post-inoculation observation time (72 h), and the lethal dose for 50% of the larvae (LD50, 105 CFU/larva). Three independent infection assays were performed (n=40 APEC samples). The inoculated larvae (10 larvae/strain) were monitored every 12 h, revealing the data for the following parameters: mortality rate (%), LD50, survival curves, in vitro (hemolymph) and visual melanization (no/minimum, medium. and maximum), cell density (hemocytes/mL), cell injury (lactate dehydrogenase enzyme, LDH), and larval disease score (0–10). Inoculation experiments demonstrated that G. mellonella larvae were susceptible to APEC infection, with mortality being dose-dependent. In addition to the low correlation with PI, the cell density and LDH variables did not show virulence discrimination power between strains. In vitro melanization showed a strong correlation (ρ=0.731) with IP; however, data from only 15 APEC isolates were used for the analysis. The variables LD50, mortality rate, and visual melanization (larva body) showed a weak association (ρ=-0.422, 0.450, and 0.456, respectively) with PI. The parameter that best characterized the pathogenicity of APEC strains was the larval disease score, possibly owing to the additive effects of four variables (mortality, melanization, cocoon formation, and activity). The correlation with PI was moderate (ρ=0.558), but statistically significant (p≤0.05). Survival curves proved to be useful in the comparative analysis between the mortality profiles caused by slightly (PI≤1.99), intermediately (PI 2–4.99), and highly pathogenic (PI≥5) APEC strains. The data generated in the present work support the suggestion that the infection model with G. mellonella larvae is a valid methodology for the determination of the pathogenicity of APEC isolates. The model proved to be definitive in the characterization of strains with well-defined virulence (apathogenic and highly pathogenic).