Avaliação do papel de proteínas Hsp12 na virulência e resposta ao estresse de Cryptococcus gattii

Abstract

O estabelecimento de infecções de leveduras patogênicas do gênero Cryptococcus depende da expressão de características que permitem a sua adaptação ao ambiente do hospedeiro. Os principais determinantes de patogenicidade são: a sua capacidade de se desenvolver na temperatura do hospedeiro (37 °C) e a produção de melanina na superfície celular e de capsula polissacarídica. Outros determinantes são importantes para o estabelecimento da infecção, entre eles, a capacidade de suplantar a resposta de estresse desenvolvida pelas defesas do hospedeiro. Para tal, ocorrem alterações importantes no perfil de expressão gênica na levedura. Foi demonstrado que as proteínas de choque térmico tem atividade fundamental na viabilidade das leveduras no ambiente do hospedeiro, pois modulam determinantes de patogenicidade e a própria resposta imunológica do hospedeiro. Neste contexto, caracterizamos duas proteínas Hsp12 (genes parálogos HSP12.1 e HSP12.2) de choque térmico de C. gattii. Mostramos que a expressão do gene HSP12.1 está aumentada durante o choque térmico e que a sua inativação, por construção de mutantes, resultou em fenótipo de sensibilidade ao composto FK506, um inibidor da via da calcineurina. Esta via é fundamental para a resposta e adaptação da levedura a diferentes tipos de estresse celular. O mutante de HSP12.1 é mais sensível ao estressor H2O2 e ocorre acumulo intracelular de ROS. Estes mutantes mostram também um fenótipo de sensibilidade ao SDS que é um estressor de membrana plasmática, sugerindo que a proteína HSP12.1 é provavelmente uma chaperona na membrana plasmática. Mostramos que a expressão do gene HSP12.1 está aumentada durante o choque térmico e que a sua inativação, por construção de mutantes, resultou em fenótipo de sensibilidade ao composto FK506, um inibidor da via da calcineurina. Esta via é fundamental para a resposta e adaptação da levedura a diferentes tipos de estresse celular. O mutante de HSP12.1 é mais sensível ao estressor H2O2 e ocorre acumulo intracelular de ROS. Estes mutantes mostram também um fenótipo de sensibilidade ao SDS que é um estressor de membrana plasmática, sugerindo que a proteína HSP12.1 é provavelmente uma chaperona na membrana plasmática. Mostramos também que a inativação do outro gene HSP12.2 não resulta em alterações fenotípicas detectáveis, indicando que este parálogo ou é inativo na levedura selvagem ou que a sua inativação provoca algum efeito compensatório. O resultado mais importante, do ponto de vista da relação C. gattii com o hospedeiro é que a inativação de HSP12.1 resulta na redução da taxa de fagocitose por macrófagos murinos que resulta em hipovirulência do mutante em modelo de infecção sistêmica em modelo invertebrado. Assim, os resultados contribuem para o entendimento das relações C. gattii com seus hospedeiros e mostram a importância do gene HSP12.1 para a sua adaptação ao estresse durante a infecção.

The establishment of pathogenic yeast infections of the genus Cryptococcus relies on the expression of determinants of pathogenicity that allow its adaptation to the host environment. The main determinants of pathogenicity are its ability to grow at host temperature (37 °C), the production of melanin on the cell surface, and a polysaccharide capsule. Other determinants are important for the establishment of the infection, including the ability to overcome the stress response developed by the host's defenses. For this purpose, significant changes occur in the gene expression profile in yeast. Heat shock proteins (HSP) have been shown to play a fundamental role in the viability of yeasts in the host environment as they modulate determinants of pathogenicity and the host's immune response. In this context, we characterized two Hsp12 proteins (genes HSP12.1 and HSP12.2) in C. gattii. We demonstrated that HSP12.1 gene expression is increased during heat shock, and its inactivation, through the construction of a null mutant, resulted in a sensitivity phenotype to the compound FK506, an inhibitor of the calcineurin pathway. This pathway is essential for the response and adaptation of yeast to different types of cellular stress. The HSP12.1 mutant also showed increased sensitivity to the H2O2 stressor and intracellular accumulation of ROS. These mutants also showed an SDS-sensitive phenotype, which acts by destabilizing the plasma membrane, suggesting that Hsp12.1 acts as a chaperone in the plasma membrane. We also demonstrated that the inactivation of the other HSP12.2 gene does not result in detectable phenotypic changes, indicating that this paralog is either inactive in wild C. gattii or that its inactivation causes some compensatory effect. The most important result, from the point of view of the C. gattii interaction with the host, is that the inactivation of HSP12.1 leads to a reduction in the rate of phagocytos by murine macrophages associated with a hypovirulence phenotype in a systemic infection model in an invertebrate model. Thus, these results contribute to the understanding of C. gattii's relations with its hosts and demonstrate the importance of the HSP12.1 gene for its adaptation to stress during infection.