Estudo da inflamação, dano oxidativo e neurodegeneração em pacientes portadores de Fenilcetonúria e em modelo animal de hiperfenilalaninemia : efeito da L-carnitina

Abstract

A Fenilcetonúria (PKU) é um erro inato do metabolismo dos aminoácidos, causada pela atividade deficiente da enzima fenilalanina hidroxilase, responsável pela hidroxilação da fenilalanina (Phe) em tirosina. Como consequência, ocorre o acúmulo da Phe e seus metabólitos tóxicos no sangue e tecidos dos pacientes. Foi descrito que pacientes com PKU em tratamento hipoproteico apresentam deficiência de L-carnitina (L-car), composto que tem demonstrado um potencial antioxidante e anti-inflamatório em doenças metabólicas. O tratamento dos pacientes consiste em uma dieta restrita em Phe e proteínas, suplementada com uma fórmula dietética, contendo aminoácidos (exceto Phe), vitaminas, minerais e nos últimos anos L-car. O presente trabalho tem por objetivo avaliar o efeito da L-car sobre o dano oxidativo, perfil inflamatório e neurodegeneração em pacientes fenilcetonúricos com diagnóstico precoce e tardio e durante o tratamento, e em modelo animal crônico quimicamente induzido de hiperfenilalaninemia, bem como no estudo comportamental no modelo animal. No primeiro capítulo, avaliamos o efeito causado pelo tempo de exposição a níveis elevados de Phe em pacientes com PKU, diagnosticados precoce e tardiamente, bem como o efeito do L-car em pacientes em tratamento através da dosagem de citocinas pró e anti-inflamatórias e marcadores de estresse oxidativo. Verificamos diminuição nos níveis de Phe e aumento nas concentrações de L-car nos pacientes PKU tratados, indicando a eficácia do tratamento dietético. Correlação inversa entre Phe versus L-car e níveis de nitrato mais nitrito versus L-car também foi demonstrada. Encontramos níveis aumentados das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IFN-gama, IL-2, TNF-alfa, IL-8 e IL-6 em pacientes com diagnóstico tardio em comparação aos controles, e IL-8 nos pacientes com diagnóstico precoce e tratamento em comparação com indivíduos saudáveis. Foram demonstrados níveis aumentados de IL-2, TNF-alfa e IL-6 nos pacientes com diagnóstico tardio em comparação com o diagnóstico precoce, e níveis reduzidos de IL-6 nos pacientes tratados em comparação com pacientes com diagnóstico tardio. Além disso, verificou-se uma correlação negativa entre IFN-gama e L-car nos pacientes tratados. No entanto, foi observado aumento dos níveis de IL-4 nos pacientes com diagnóstico tardio em comparação com o diagnóstico precoce, e redução nos pacientes tratados em comparação com pacientes com diagnóstico tardio. Na urina, onde não realizados distinção entre os grupos de pacientes com 14 diagnóstico precoce ou tardio, considerando apenas como grupo diagnóstico, houve um aumento nos níveis de 8-isoprostanos (dano a lipídios) nos pacientes e uma redução nos níveis das espécies de guanina oxidada (dano ao DNA) nos pacientes tratados em comparação com os pacientes no diagnóstico. Assim, a suplementação com L-car induziu efeitos benéficos nesses processos reduzindo ou atenuando os níveis dos biomarcadores aumentados, bem como melhorando a capacidade antioxidante e anti-inflamatória desses pacientes. No segundo capítulo, avaliamos marcadores plasmáticos de neurodegeneração em pacientes com PKU com diagnóstico precoce e tardio e em tratamento. Encontramos redução nos níveis de Phe e aumento das concentrações de L-car em pacientes tratados com L-car. Verificamos aumento de BDNF nos pacientes em tratamento comparado aos pacientes com diagnóstico precoce. Correlação positiva entre BDNF e L-car e correlação negativa entre BDNF e Phe foram observadas. Esses resultados sugerem uma tentativa de ajuste na plasticidade neuronal e recuperação da injúria sofrida, refletindo uma resposta compensatória à lesão cerebral, nos pacientes PKU tratados. No terceiro capítulo, avaliamos os efeitos do tratamento com L-car no córtex cerebral de ratos submetidos a um modelo crônico quimicamente induzido de HPA, avaliando dano oxidativo, neuroinflamação e testes comportamentais. Confirmamos a eficácia do modelo animal, através do aumento de Phe e L-car no sangue e no córtex cerebral. A L-car foi eficaz em diminuir significativamente a geração de espécies reativas (DCF) e atenuar a atividade da superóxido dismutase (SOD). Correlações negativas significativas entre SOD e DCF versus L-car foram observadas. Ainda, a L-car atenuou a diminuição dos níveis de IL-4, demonstrando importante efeito anti-inflamatório, além do efeito protetor contra a neuroinflamação, através da diminuição da superexpressão da proteína glial fibrilar ácida (GFAP). No teste de campo aberto, não foi verificada diferença estatístisca significativa nos parâmetros comportamentais avaliados. Concluimos que o dano oxidativo, a inflamação e neurodegeneração estão envolvidos na fisiopatologia da PKU e que a L-car demonstrou ser um importante adjuvante no tratamento dos pacientes PKU, prevenindo o dano oxidativo e a inflamação tanto a nível periférico em pacientes quanto a nível central em ratos HPA.

Phenylketonuria (PKU) is an inborn error of amino acid metabolism, caused by deficient of phenylalanine hydroxylase activity, enzyme responsible for hydroxylation of phenylalanine (Phe) to tyrosine. As consequence, the accumulation of Phe and its toxic metabolites in blood and tissues of phenylketonuric patients occurs. It was described that PKU patients under hypoproteic treatment present L-carnitine (L-car) deficiency, compound that has demonstrated an antioxidant and anti-inflammatory role in metabolic diseases. The treatment for PKU consists in a Phe and protein-restricted diet, supplemented with a dietary formula containing amino acids (except Phe), vitamins, minerals, and in recent years L-car. The present work aims to evaluate the effect of L-car on oxidative damage, inflammatory profile and neurodegeneration in phenylketonuric patients with early and late diagnosis and during treatment, and in a chronic chemically-induced model of hyperphenylalaninemia, as well as in the behavioral study in the animal model. In the first chapter, we evaluated the effect caused by the time of exposure to high levels of Phe in patients with PKU, diagnosed early and late, as well as the effect of L-car in patients in treatment through the measurement of pro and anti-inflammatory cytokines and oxidative stress markers. We verified a decrease in Phe levels and an increase in L-car concentrations in treated PKU patients, indicating the effectiveness of the dietary treatment. Inverse correlation between Phe versus L-car and nitrate plus nitrite levels versus L-car has also been demonstrated. We found increased pro-inflammatory cytokines IL-1β, IFN-gamma, IL-2, TNF-alpha, IL-8 and IL-6 levels in patients at late diagnosis compared to controls, and IL-8 in the patients at early diagnosis and treatment compared to healthy individuals. Increased IL-2, TNF-alpha and IL-6 levels in the patients at late diagnosis compared to early diagnosis were shown, and reduced IL-6 levels in treated patients compared to patients at late diagnosis. Moreover, it verified a negative correlation between IFN‐gamma and L‐car in treated patients. Otherwise, it was observed that there were increased IL‐4 levels in the patients at late diagnosis compared to early diagnosis, and reduction in treated 16 patients compared to late diagnosed patients. In the urine, where no distinction was made between the groups of patients with early or late diagnosis, considering only as diagnostic group, there was an increase in 8-isoprostanes levels (damage to lipids) in the diagnosed patients and a reduction in the guanine species oxidized levels (DNA damage) in treated patients compared to patients at diagnosis. Thus, L-car supplementation induced beneficial effects in these processes by reducing or attenuating the levels of increased biomarkers, as well as improving the antioxidant and anti-inflammatory capacity of these patients. In the second chapter, we evaluated plasma markers of neurodegeneration in PKU patients with early and late diagnosis and during treatment. We found a reduction in Phe levels and an increase in L-car concentrations in patients treated with L-car. We found an increase in BDNF in treated patients compared to patients at early diagnosis. Positive correlation between BDNF and L-car and negative correlation between BDNF and Phe were observed. These results suggest an attempt to adjust neuronal plasticity and recovery injury suffered, reflecting a compensatory response to brain injury in treated PKU patients. In the third chapter, we evaluated the effects of L-car treatment on cerebral cortex of rats submitted to a chronic chemically-induced model of HPA, evaluating oxidative damage, neuroinflammation and behavioral tests. We confirmed the effectiveness of the animal model, through the increase of Phe and L-car in the blood and in the cerebral cortex. L-car was effective of significantly decreasing the generation of reactive species (DCF) and attenuating the activity of superoxide dismutase (SOD). Significant negative correlations between SOD and DCF versus L-car were observed. Thus, L-car attenuated the decrease in IL-4 levels, demonstrating an important anti-inflammatory effect, in addition to the protective effect against neuroinflammation, by decreasing the overexpression of glial fibrillary acidic protein (GFAP). In the open field test, no statistically significant difference was found in the behavioral parameters evaluated. We concluded that oxidative damage, inflammation and neurodegeneration are involved in the pathophysiology of PKU and that L-car proved to be an important adjuvant in the treatment of PKU patients, preventing oxidative damage and inflammation both peripherally in patients and centrally in HPA mice.