Estudo de interações proteicas com o produto do gene de DNA PSO5/RAD16 na levedura Saccharomyces cerevisiae
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Data
1999Autor
Orientador
Nível acadêmico
Doutorado
Tipo
Resumo
O gene PSO5, alelo ao RAD 16 de Saccharomyces cerevisiae pertence a via de reparação de DNA excisão/ressíntese, também chamada de via RAD3. Este gene está implicado na reparação de lesões do tipo dímeros de pirimidina, induzidas por radiação UV, em regiões não transcritas e silenciosas do genoma, assim como em reparação de lesões oxidativas e adutos de psoraleno fotoativados. A proteína codificada por este gene pertence à família SNF2 de helicases. Neste trabalho, utilizou-se o sistema di-híbri ...
O gene PSO5, alelo ao RAD 16 de Saccharomyces cerevisiae pertence a via de reparação de DNA excisão/ressíntese, também chamada de via RAD3. Este gene está implicado na reparação de lesões do tipo dímeros de pirimidina, induzidas por radiação UV, em regiões não transcritas e silenciosas do genoma, assim como em reparação de lesões oxidativas e adutos de psoraleno fotoativados. A proteína codificada por este gene pertence à família SNF2 de helicases. Neste trabalho, utilizou-se o sistema di-híbrido com o objetivo de buscar candidatos a possíveis interatores para a proteína Rad16. O sitema di-híbrido consiste de um ensaio genético desenvolvido na própria levedura, que proporciona não apenas o estudo entre interações proteicas, como também favorece o estudo dos domínios ou resíduos que podem ser críticos para que a interação aconteça. Após o screening com um banco genômico de S. cerevisiae, obteve-se três seqüências codificantes diferentes, sendo uma delas relativa ao gene SGS1, com o qual prosseguiu-se o trabalho. A proteína Sgs1 também é uma helicase, porém pertencente a família RecQ de E. coli. Ela interage com as topoisomerases II e III e está envolvida com o envelhecimento precoce em levedura. Em humanos, apresenta homologia com com as protéinas Wrn e Blm, responsáveis pelas "Síndrome de Werner" e "Síndrome de Bloom", relacionadas, respectivamente, com os fenótipos de envelhecimento precoce e predisposição ao câncer. No Capítulo I, demonstra-se que a interação entre as proteínas Sgs1 e Rad16 é fisica e genética. Através de estudos com mutantes simples e duplos, mostra-se que o gene SGS1 exerce um papel importante em reparação de DNA. Isso é devido ao fato que os mutantes sgs1 foram sensíveis a agentes alquilantes, como MMS e HN2, bem como a radiação UVC, ao UV-mimético 4-NQO e a H2O2. Observou-se uma interação epistática entre RAD16 e SGS1 para alguns destes agentes testados. Além disso, verificou-se que o tempo de geração de uma linhagem mutante rad16 é menor do que uma linhagem selvagem correspondente, sugerindo que o produto deste gene possa estar relacionado também com o envelhecimento precoce. Com a finalidade de estudar qual o domínio da proteína Sgs1 pudesse estar relacionado com reparação de DNA, utilizaram-se linhagens sgs1, contendo mutações nos seus domínios helicase e C-terminal. No Capítulo II, demonstra-se que a função helicase é responsável pela maioria dos fenótipos de sensibilidade aos agentes genotóxicos testados, bem como pela sensibilidade de sgs1 a hidroxiuréia. O fato de Sgsl interagir também com Top3 levou-nos a estudar o papel desta topoisomerase também em reparação de DNA. No Anexo, apresenta-se os resultados de sensibilidade de simples, duplos e triplos mutantes para os genes SGS1, TOP3 e RAD16. As diferentes respostas obtidas para cada agente mutagênico testado, leva-nos a concluir que estas proteínas estejam envolvidas em reparação de lesões específicas, destacando-se a importância de Top3 na reparação de alquilações do DNA. ...
Abstract
The Saccharomyces cerevisiae PSO5 gene, allelic to RAD 16, belongs to the excision-resynthesis DNA repair pathway that is also called RAD3. This gene is involved in the repair of UV-induced pirimidine dimers of the non-transcribed and silent regions of the genome, as well as in oxidative damage repair and photoactivated psoralen adducts. The encoding protein belongs to the SNF2 family of helicases. ln this work, the two-hybrid system was used in order to search putative interactors for the Rad1 ...
The Saccharomyces cerevisiae PSO5 gene, allelic to RAD 16, belongs to the excision-resynthesis DNA repair pathway that is also called RAD3. This gene is involved in the repair of UV-induced pirimidine dimers of the non-transcribed and silent regions of the genome, as well as in oxidative damage repair and photoactivated psoralen adducts. The encoding protein belongs to the SNF2 family of helicases. ln this work, the two-hybrid system was used in order to search putative interactors for the Rad16 protein. The two-hybrid system is a yeast-based genetic assay for detecting not only protein interactions, but also to delineate domains or residues critical for the interaction. After a screening with a S. cerevisiae genomic library, three encoding sequences were identified, one of these was SGS1, used for further study. The Sgs1 protein is also a helicase, but belongs to the E.coli RecQ family. It interacts with both topoisomerases II and III and is involved in yeast premature aging. ln humans, it shows homology with Wrn and Blm proteins, which are responsible for the Werner Syndrome and the Bloom Syndrome, related to premature aging and to predisposition to cancer phenotypes, respectively. ln Chapter 1, it is shown that the proteins Sgs1 and Rad16 interact physically and genetically. The study of single and double mutants has demonstrated that SGS1 gene has an important role in DNA repair. This is due to the fact that sgs1 mutants were sensitive to alkylating agents, like MMS and HN2, as well as to UVC radiation, to UV-mimetic 4-NQO and to H2O2. An epistatic interaction between RAD16 and SGS1 was observed after treatment with some of these agents. Additionally, it was verified that the life span of a rad16 mutant strain is lower that its corresponding wild type, suggesting that the gene product could also be implicated with premature aging. ln order to study which domain of Sgs1 could be related to DNA repair, different sgs1 strains were used, containing mutations in the helicase and C-terminal domains. ln Chapter II, it is shown that the helicase function is responsible for most mutagen sensitivity phenotypes, and also to the sgs1 sensitivity to hydroxyurea. The fact that Sgs1 interacts with Top3, led us to study the role of topoisomerase III in DNA repair. ln the Appendix, the results of sensitivity tests of single, double and triple mutants for SGS1, TOP3 and RAD16 genes is shown. The different responses obtained for each mutagen tested, lead us to conclude that these proteins are involved in the repair of specific DNA lesions, emphasizing the important role of Top3 in the repair of DNA alkylations. ...
Instituição
Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de Ciências Básicas da Saúde. Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica.
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