Aplicação de quimiometria nos parâmetros que influenciam a susceptibilidade e na identificação de fungos de importância médica

Abstract

Leveduras de importância clínica como Candida spp. são microrganismos mais frequentemente isolados em infecções do trato urogenital, gastrointestinal e sanguíneo. A dificuldade em sua diferenciação e identificação devido à inespecificidade de testes bioquímicos ou ao não acesso às ferramentas mais precisas como as biomoleculares pode levar a recomendação de tratamentos menos efetivos. A similaridade com outras leveduras como as leveduras do gênero Cryptococcus pode ocasionar a erros de identificação e posteriormente tratamento. Além disso, a realização de testes de susceptibilidade através de inóculos com grande variabilidade causa prejuízos quanto à precisão do teste não concendendo ao analista poder decisório quanto à eficácia do antifúngico. Outros parâmetros como concentração de glicose, temperatura e pH podem influenciar o crescimento e inibição de leveduras de importância médica como as do gênero Candida. Assim, a presente tese teve como objetivo avaliar o preparo de inóculos do gênero Candida através da espectroscopia UV-Vis. Estimar o pH em meio de cultura em microvolumes através de imagens digitais. Estimar o impacto de pequenas alterações na temperatura, inóculo, pH e glicose no crescimento e inibição de cepas de Candida spp. Realizar a classificação de espécies de Candida através do emprego de imagens digitais oriundas de meio cromogênico. E, por fim, diferenciar e classificar leveduras do gênero Cryptococcus na presença de outras espécies de Candida spp. através do emprego da espectroscopia na região do infravermelho (FTIR) associada à quimiometria. Para atingir esses objetivos, foram utilizadas ferramentas quimiométricas que foram desde o delineamento experimental (DoE), regressão multivariada e classificação multivariada com diferentes matrizes de dados como imagens digitais, unidades de absorbância na espectroscopia ultravioleta e espectroscopia de infravermelho. Os resultados obtidos demonstraram que através da dispersão de quantidades conhecidas de blastoconídeos e obtenção de medidas espectrofotométricas permitiram maior precisão no preparo de inóculos. A determinação do pH através do emprego de imagens digitais em microvolumes em placas de 96 e 24 poços é uma opção vantajosa, pois permite a estimação do pH sem a quebra de esterilidade. Os resultados do DoE apontam 14 que mesmo pequenas modificações no inóculo, concentração de glicose e pH geram alterações significativas tanto para crescimento como para inibição. Imagens digitais do meio cromogênico associadas as ferramentas quimiométricas permitiram a classificação de cinco diferentes espécies de Candida com precisão e exatidão. E por fim, a diferenciação de duas espécies de Cryptococcus é possível mesmo com 13 outras espécies de Candida mostrando que o FTIR rivaliza em potencialidade com outras técnicas de identificação.

Clinically important yeasts such as Candida spp. are microorganisms most frequently isolated in infections of the urogenital, gastrointestinal, and blood tract. The difficulty in differentiating and identifying them due to the lack of specificity of biochemical tests or the lack of access to more precise tools as biomolecular ones can lead to the recommendation of less effective treatments. The similarity with other yeasts as yeasts of the genus Cryptococcus can lead to misidentification and subsequent treatment. In addition, carrying out susceptibility tests using inoculums with significant variability causes losses in terms of test accuracy, not granting the analyst decision-making power regarding the efficiency of the antifungal agent. Other parameters such as glucose concentration, temperature, and pH can influence the growth and inhibition of medically important yeasts as those of the genus Candida. Thus, the present thesis aimed to evaluate the preparation of the inoculum of the genus Candida through UV-Vis spectroscopy. Estimate the pH in culture medium in microvolumes through digital images. Estimate the impact of small changes in temperature, inoculum size, pH, and glucose concentration on the growth and inhibition of Candida spp. Perform the classification of Candida species through digital images from a chromogenic medium. And, finally, to differentiate and classify yeasts of the genus Cryptococcus in the presence of other species of Candida spp. through spectroscopy in the infrared region (FTIR) associated with chemometrics. Chemometric tools were applied to achieve these objectives, ranging from experimental design (DoE), multivariate regression, and multivariate classification with different data matrices as digital images and absorbance units in ultraviolet and infrared spectroscopy. The results showed that dispersing known quantities of blastoconidia and obtaining spectrophotometric measurements precision in the inoculum preparation. The pH determination through digital images in microvolumes in 96 and 24 well plates is an advantageous option, as it allows the estimation of the pH without sterility loss. The DoE results indicate that even tiny modifications in the inoculum size, glucose concentration and pH generate significant alterations both for growth and inhibition. Digital images of the chromogenic medium associated with 16 chemometric tools allowed the classification of five different Candida species with precision and accuracy. And finally, the differentiation of two species of Cryptococcus is possible even with 13 other species of Candida showing that FTIR rivals in potentiality with other identification techniques.