O papel de RNAs não-codificantes no desenvolvimento do diabetes mellitus e da doença renal do diabetes

Abstract

Os RNAs não codificantes (ncRNAs) são um grande grupo de RNAs que não têm funções aparentes de codificação de proteínas, mas desempenham papéis importantes em diversos processos biológicos, incluindo a patogênese de doenças. Dentre os ncRNAs, duas classes vêm sendo amplamente estudadas, os microRNAs (miRNAs) e os RNAs nãocodificantes longos (lncRNAs). Os miRNAs são pequenos ncRNAs que regulam a expressão gênica. Mudanças na expressão de miRNAs foram observadas em diversas situações patológicas, incluindo no diabetes mellitus (DM) e suas complicações crônicas. Os estudos que relacionaram miRNAs circulantes, urinários ou renais com a doença renal do diabetes (DRD) sugerem que um perfil de miRNAs parece se alterar nas diferentes fases desta complicação. Entretanto, os resultados desses estudos ainda são inconclusivos. Sendo assim, estudos ainda são necessários para identificar um perfil alterado de expressão de miRNAs em pacientes com DRD. Os miRNAs encontrados em fluidos biológicos, tais como no sangue e na urina, são de especial interesse como potenciais biomarcadores, pois podem ser coletados facilmente e são estáveis sob diferentes condições de estocagem. Nesse sentido, os miRNAs urinários podem ser possíveis candidatos a biomarcadores da DRD, especialmente porque não são eliminados durante o processo de hemodiálise, não sofrem filtração glomerular e podem refletir mais diretamente alterações renais ao contrário de miRNAs circulantes no plasma ou soro, os quais podem estar marcando alterações em outros tecidos. Além disso, a coleta de urina aleatória é fácil de ser realizada, não necessita jejum e pode ser realizada a qualquer momento do dia. Dessa forma, realizou-se uma análise do miRNoma urinário (análise de todos os miRNAs maduros conhecidos) em pacientes com DRD [progressores vs. não-progressores para declínio rápido na taxa de filtração glomerular estimada (TFGe)] e em pacientes sem essa complicação com o objetivo de identificar um perfil de miRNAs urinários envolvidos no desenvolvimento e progressão da DRD em pacientes com DM tipo 1 (DM1). Para isso, realizamos uma fase de screening, onde foi feita a análise do miRNoma urinário em pacientes com DM1, sendo 6 sem DRD e 14 com DRD [divididos em progressores (n= 7) e não-progressores (n= 7) em relação à diminuição rápida na TFGe (declínio ≥ 3,5 mL/min/1,73m2/ano) durante o período de seguimento do estudo (média de 11.6  3.6 anos)]. O microarray foi realizado utilizando o GeneChip miRNA 4.0 arrays (Thermo Fisher Scientific). Como resultado, identificamos 79 miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos. Entre esses, 63 diferiram entre progressores vs. pacientes com TFGe normal; 12 entre não-progressores vs. pacientes com TFGe normal; e 15 entre progressores vs. nãoprogressores. Análises de bioinformática mostraram que esses miRNAs estão envolvidos em vias associadas com o DM e a DRD. Após a análise do miRNoma, 2 miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos da amostra screening foram selecionados para validação individual por real-time PCR. Isso foi feito em uma amostra independente de 46 pacientes com DM1: 18 sem DRD e 28 com DRD, também divididos entre progressores (n = 12) e não-progressores (n = 16) para diminuição rápida na TFGe. Confirmamos que o hsamiR- 30a-5p está aumentado em pacientes progressores vs. não-progressores e pacientes sem DRD. O hsa-miR-210-3p não teve seu resultado confirmado nesta amostra de validação. Além disso, realizamos uma segunda validação comparando os nossos dados do miRNoma com dados de um estudo de transcriptômica disponível no banco de dados público GEO (GSE121221). Esta análise confirmou que os hsa-miR-212-5p, hsa-miR-4484 e hsa-miR- 4487 apresentam níveis de expressão diminuídos em pacientes com DRD em comparação aos pacientes sem esta complicação. Como conclusão desse primeiro artigo, os hsa-miR- 30a-5p, hsa-miR-212-5p, hsa-miR-4484 e hsa-miR-4487 foram validados como potenciais biomarcadores para a progressão da DRD em pacientes com DM1. Além de investigar o papel dos miRNAs na DRD, também avaliamos o envolvimento de lncRNAs no desenvolvimento do DM e da DRD. Os lncRNAs são moléculas de RNA longas (> 200 nucleotídeos) que estruturalmente se assemelham ao mRNA, mas não codificam proteínas. Essa classe de RNA não codificante já foi associada com funções como de regulação da expressão gênica, controle do ciclo celular, transcrição, regulação do splicing, diferenciação celular, inativação do cromossomo X e imprinting gênico. Interessantemente, lncRNAs têm sido identificados em condições normais e patológicas, podendo funcionar como biomarcadores de diversas doenças, tais como o DM e suas complicações crônicas. Desta forma, visando proporcionar um melhor entendimento do papel do lncRNAs no desenvolvimento do DM, realizamos uma revisão sistemática e um estudo de caso-controle, seguido de análises de bioinformática, com o objetivo de encontrar lncRNAs associados ao DM. A revisão sistemática incluiu 53 estudos que investigaram a expressão de lncRNAs em pacientes com DM1 ou DM tipo 2 (DM2). Como resultado, encontramos 6 lncRNAs consistentemente desregulados em pacientes com DM (ANRIL, HOTAIR, MALAT1, MIAT, KCNQ1OT1 e MEG3) em comparação ao grupo controle. Análises de bioinformática demonstraram que esses lncRNAs estão envolvidos em vias relacionadas ao DM, tais como PI3K/Akt, MAPK, apoptose e FoxO. No estudo de caso-controle, investigamos a expressão dos lncRNAs MALAT1, MEG3, MIAT, PVT1 e TUG1 em células mononucleares de 27 pacientes com DM1 (casos) e 13 indivíduos saudáveis (controles). O grupo caso foi dividido em: 14 pacientes com <5 anos de diagnóstico de DM1 e 13 pacientes com ≥5 anos de diagnóstico. As expressões dos lncRNAs MALAT1 e TUG1 foram aumentadas em pacientes com <5 anos de DM1 em comparação ao grupo controle e pacientes com ≥5 anos de diagnóstico. A expressão de MEG3 também estava aumentada nos pacientes <5 anos de DM1 vs. controles. Interessantemente, os níveis de expressão de MALAT1 e TUG1 foram negativamente correlacionados com o tempo de DM1 e os níveis de MEG3 e TUG1 foram positivamente correlacionados com os valores de hemoglobina glicada. Além dos estudos em relação ao papel dos lncRNAs no contexto do DM, também avaliamos o envolvimento dessa classe de RNAs no desenvolvimento da DRD. Assim, em um primeiro estudo, avaliamos as expressões dos lncRNAs MALAT1 e TUG1 na urina de pacientes com DM1 categorizados em: 18 pacientes com DRD (casos) e 9 pacientes sem esta complicação (controles). A expressão do lncRNA MALAT1 foi aumentada na urina dos pacientes com DRD em comparação ao grupo controle. Análises de bioinformática mostraram que esses dois lncRNAs estão envolvidos em vias relacionadas ao DM e a DRD, tais como glicólise/gliconeogênese, PI3K-Akt, AMPK e a via do DM1. Num segundo estudo relacionado à associação de lncRNAs com DRD, comparamos as frequências dos polimorfismos rs3200401/MALAT1, rs1894720/MIAT, rs3931283/PVT1, rs11993333/PVT1, rs5749201/TUG1 e rs7158663/MEG3 entre 902 pacientes com DM2 com DRD (casos) e 394 pacientes com DM2 sem DRD (controles). Como resultado, o genótipo G/G do polimorfismo rs3931283/PVT1 foi associado com risco para DRD após ajuste para covariáveis. Em concordância, os pacientes com o genótipo G/G também apresentaram níveis maiores de excreção urinária de albumina (EUA) em comparação aos pacientes com o genótipo A/A. Interessantemente, pacientes com o genótipo G/G do polimorfismo rs7158663/MEG3 tiveram níveis diminuídos de creatinina e valores aumentados de TFGe comparado aos portadores do alelo A. Além disso, o alelo G deste polimorfismo no gene MEG3 foi associado com proteção para DRD severa. Em conclusão, os estudos incluídos nesta tese evidenciaram o papel de ncRNAs no DM e na DRD, demonstrando a contribuição de fatores epigenéticos no desenvolvimento dessas patologias. Um perfil de miRNAs associados com o desenvolvimento e progressão de DRD em pacientes com DM1 foi identificado. Além disso, nossos estudos indicam o envolvimento dos lncRNAs na patogênese do DM e da DRD, através de alterações nos seus níveis de expressão como também por meio da presença de polimorfismos genéticos nesses lncRNAs.

Non-coding RNAs (ncRNAs) are a large group of RNAs that have no apparent protein-coding functions, but play important roles in diverse biological processes, including in the pathogenesis of diseases. Among ncRNAs, two classes have been widely studied, microRNAs (miRNAs) and long non-coding RNAs (lncRNAs). MiRNAs are small non-coding RNAs that negatively regulate gene expression. Changes in miRNA expressions have been observed in several pathological situations, including in diabetes mellitus (DM) and its chronic complications. The studies that have associated circulating, urinary, or renal miRNAs with diabetic kidney disease (DKD) suggest that a miRNA profile seems to be altered in the different stages of this disease. However, the results of these studies are still inconclusive. Therefore, additional studies are necessary to identify an altered profile of miRNA expression in patients with DKD. MiRNAs found in biological fluids, such as circulating and urinary miRNAs, are of special interest as potential biomarkers since they can be collected easily and are stable under different storage conditions. In this context, urinary miRNAs could be potential biomarkers of DKD, specially because they are not eliminated during the hemodialysis process, do not undergo glomerular filtration, and may more directly reflect renal changes as opposed to circulating miRNAs in plasma or serum, which may be marking changes in other tissues. Moreover, a random urine collection is easy to perform, does not require fasting, and can be performed at any time of the day. Therefore, a urinary miRNoma analysis (analysis of all known mature miRNAs) was performed in patients with DKD [progressors vs. non-progressors for a rapid decline in the estimated glomerular filtration rate (eGFR)] and patients without this complication, aiming to identify a profile of urinary miRNAs involved in the development and progression of DKD in patients with type 1 DM (T1DM). For this, in a screening phase, the urinary miRNoma was analyzed in 6 patients with T1DM without DKD and 14 with T1DM and DKD [divided into progressors (n= 7) and non-progressors (n= 7) in relation to a rapid decline in eGFR (≥ 3.5 mL/min/1.73 m2/year) during the study follow-up (mean of 11.6  3.6 years)]. The miRNoma was performed with the microarray technique, using the GeneChip miRNA 4.0 arrays (Thermo Fisher Scientific). As a result, we identified 79 differentially expressed miRNAs between groups. Of these, 63 differed between progressors vs. patients with normal eGFR; 12 between non-progressors vs. patients with normal eGFR; and 15 between progressor vs. non-progressor groups. Bioinformatics analyses showed that these miRNAs are involved in pathways associated with DM and DKD. After miRNoma analysis, 2 differentially expressed miRNAs between groups of the screening sample were selected for individual validation by real-time PCR. This was done in an independent sample of 46 T1DM patients: 18 without DKD and 28 with DKD, also divided into progressors (n= 12) and non-progressors (n= 16) for a rapid decrease in eGFR. We confirmed that hsa-miR- 30a-5p is increased in progressors vs. non-progressor patients and patients without DKD. Hsa-miR-210-3p was not confirmed in the validation sample. In addition, we performed a second validation comparing our miRNoma data with data from a transcriptomic study available in the public GEO database (GSE121221). This analysis confirmed that hsa-miR- 212-5p, hsa-miR-4484 and hsa-miR-4487 show decreased expression levels in patients with DKD compared to patients without this complication. As a conclusion of this first paper, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-212-5p, hsa-miR-4484, and hsa-miR-4487 were validated as potential biomarkers of DKD progression in T1DM patients. In addition to the study of the role of miRNAs in DKD, we also evaluated the involvement of lncRNAs in the development of DM and DKD. LncRNAs are RNAs with 200 nucleotides that structurally resemble mRNAs but are unable to encode proteins. This class of non-coding RNAs has already been associated with functions such as regulation of gene expression, cell cycle control, transcription, splicing regulation, cell differentiation, X chromosome inactivation, and gene imprinting. Interestingly, lncRNAs have a key role in many physiological and pathological processes and, therefore, can be biomarkers of several diseases, including DM and DKD. Thus, to provide a better understanding of the role of lncRNAs in the development of DM, we carried out both a systematic review and a casecontrol study, followed by bioinformatics analysis, to find lncRNAs associated with DM. The systematic review included 53 studies that investigated lncRNA expressions in patients with T1DM or type 2 DM (T2DM). As a result, we found 6 lncRNAs consistently dysregulated in patients with DM (ANRIL, HOTAIR, MALAT1, MIAT, KCNQ1OT1, and MEG3) compared to the control group. Bioinformatics analyses demonstrated that these lncRNAs are involved in DM-related pathways, such as PI3K/Akt, MAPK, apoptosis, and FoxO. In the case-control study, we investigated the expression of lncRNAs MALAT1, MEG3, MIAT, PVT1, and TUG1 in mononuclear cells from 27 T1DM patients (cases) and 13 healthy individuals (controls). The case group was divided into 14 patients with <5 years of diagnosis of T1DM and 13 patients with ≥5 years of diagnosis. LncRNAs MALAT1 and TUG1 expressions were increased in patients with <5 years of T1DM compared to the control group and patients with ≥5 years of diagnosis. MEG3 expression was also increased in T1DM patients <5 years of diagnosis vs. controls. Interestingly, MALAT1 and TUG1 expressions were negatively correlated with T1DM duration, and MEG3 and TUG1 levels were positively correlated with glycated hemoglobin values. Besides the studies about the role of lncRNAs in the DM context, we also evaluated the involvement of this type of RNAs in the development of DKD. Thus, in a first study, we evaluated the expressions of lncRNAs MALAT1 and TUG1 in the urine of patients with T1DM categorized into 18 patients with DKD (cases) and 9 patients without this complication (controls). LncRNA MALAT1 expression was increased in the urine from DKD patients compared to the control group. Bioinformatics analyses showed that these two lncRNAs are involved in pathways related to DM and DKD, such as glycolysis/gluconeogenesis, PI3K-Akt, AMPK, and the T1DM pathway. In a second study related to the association of lncRNAs with DKD, we compared the frequencies of rs3200401/MALAT1, rs1894720/MIAT, rs3931283/PVT1, rs11993333/PVT1, rs5749201/TUG1, and rs7158663/MEG3 polymorphisms between 902 T2DM patients with DKD (cases) and 394 T2DM patients without DKD (controls). As a result, we demonstrated that the G/G genotype of the rs3931283/PVT1 polymorphism was associated with risk for DKD after adjusting for covariates. Accordingly, patients with the G/G genotype of this polymorphism also had higher levels of urinary albumin excretion (UAE) compared to patients with the A/A genotype. Interestingly, patients carrying the G/G genotype of the rs7158663/MEG3 polymorphism had decreased creatinine levels and increased eGFR values compared to A allele carriers. Furthermore, the G allele of the MEG3 polymorphism was associated with protection against severe DKD. In conclusion, the studies included here showed the role of ncRNAs in DM and DKD, demonstrating the contribution of epigenetic factors in the development of these pathologies. A profile of miRNAs associated with the development and progression of DKD was identified in T1DM patients. Furthermore, our studies indicate the involvement of lncRNAs in the pathogenesis of DM and DKD through alterations in their expression levels as well as the presence of genetic polymorphisms in these lncRNAs.