Microbiologia do leite de ovelha e queijos produzidos no sul do Brasil : um estudo sobre a microbiota, qualidade microbiológica e resistência a antimicrobianos de Staphylococcus spp. isolados

Abstract

O leite de ovelha e o queijo, vêm se destacando como uma importante atividade agropecuária no Brasil. Estes apresentam valor agregado e benefícios à saúde. O queijo apresenta uma microbiota própria, relacionada a qualidade do leite. A presença de microrganismos pode ser responsável pela deterioração e causa de infecções alimentares. O presente estudo teve por objetivo avaliar a diversidade microbiana presente em amostras de leite cru de ovelha e dos queijos produzidos na região sul do Brasil, assim como a qualidade microbiológica e presença de microrganismos resistentes a antimicrobianos beta-lactâmicos, rifanpicinas, oxazolidinonas, sulfonamidas, macrolídeos, fluoroquinolonas, tetraciclinas, nitrofuranos, anfenicois e lincosamidas. As amostras de leite cru foram coletadas em três fazendas distintas (n = 5 cada fazenda) e amostras de quatro tipos de queijo – tipo-feta, frescal, colonial e tipo pecorino, (n = 5 cada) - foram obtidas em fazendas e/ou adquiridas no comércio local. Para a análise da microbiota, o DNA das amostras foi extraído e a região V4 do gene 16S rRNA foi amplificada por PCR. Após, as amostras foram submetidas ao sequenciamento de alto desempenho no equipamento MiSeq da Illumina. A qualidade microbiológica e a análise de enterotoxinas foram determinadas pelos métodos petrifilm e VIDAS SET2, respectivamente. Foi realizado o isolamento de Staphylococcus spp., que foram avaliados quando à suscetibilidade antimicrobiana e a presença de genes de resistência tet(L), sul1, sul2, ermB, tetM, GN, tetW e strA. Os resultados do sequenciamento mostraram 501 Variantes de Sequências de Amplicons (ASV), sendo 429 ASV correspondentes a amostras de leite e 72 ASV para as amostras de queijo. Os índices de Chao1 e Shannon mostraram que a diversidade bacteriana nas amostras de queijos foi inferior às amostras de leites. As amostras de leites mostraram a presença de 87 gêneros, incluindo Phyllobacterium spp. (42,59%), Staphylococcus spp. (29,20%), Pseudomonas spp. (10,96%), Lactococcus spp. (5,10%) e Acinetobacter spp. (1,38%). Nas amostras de queijos, os gêneros mais abundantes foram os Streptococcus spp. (73,15%), Lactobacillus spp. (19,91%), Lactococcus spp. (2,46%) e Staphylococcus spp. (1,74%). A análise de beta diversidade mostrou que houve diferenças significativas na estrutura das comunidades microbianas entre as amostras de leite e queijos. Com relação ao estudo de segurança dos alimentos, foi possível observar uma maior contagem de microrganismos nas amostras de leite de ovelha cru do que no queijo. Em relação a ocorrência de enterotoxinas foi observada em uma amostra de leite. Foram obtidos 39 isolados de Staphylococcus spp. (15 em queijo e 24 em leite de ovelha cru). Em 12,5% de leite de ovelha cru foi identificado S. aureus e outras espécies foram identificadas: S. sciuri, S. simulans, S. lentus, S. pseudintermedius, S. chromogenes e S. warneri. Com relação ao perfil fenotípico de resistência a antimicrobianos, 90% dos isolados apresentaram resistência a pelo menos um antimicrobiano avaliado, e a multirresistência foi detectada em cepas de S. aureus, S. pseudintermedius e Staphylococcus coagulase negativa. Quanto aos genes de resistência, 82% dos isolados carregavam o gene tetM, 59% o ermB, 36% o strA, 28% o tetL, 23% o gene sul1 e 3% GN e sul2. O gene tetW não foi detectado em nenhum isolado. Esses achados impactam a indústria de laticínios, representando um risco à saúde pública. Os resultados podem auxiliar na estruturação de estratégias que garantam a qualidade e segurança dos produtos, servindo de base para a criação de legislação específica para leites de ovelha e queijos produzidos no Brasil.

Sheep's milk and cheese have been highlighted as an important agricultural activity in Brazil. These have added value and health benefits. Since cheese has its own microbiota, which is related to milk quality. Nonetheless, the presence of microorganisms responsible for spoilage and food infections must be investigated. Thus, the present study aimed to evaluate the microbial diversity present in samples of raw sheep milk and cheese produced in southern Brazil, as well as the microbiological quality. Presence of microorganisms resistant to antimicrobials as beta-lactam, rifanpicins, oxazolidinones, sulfonamides, macrolides, fluoroquinolones, tetracyclines, nitrofurans, amphenicols and lincosamides. In addition, the isolation of species of Staphylococcus spp. Raw milk samples were collected from three different farms (n = 5 each farm) and samples of four types of cheese - feta-type, fresh, colonial and pecorino-type, (n = 5 each) - were obtained from farms and/or or purchased from local businesses. For the analysis of the microbiota, the DNA of the samples was extracted and the V4 region of the 16S rRNA gene was amplified by PCR. Afterwards, the samples were submitted to highperformance sequencing in the MiSeq equipment from Illumina. Microbiological quality and enterotoxin analysis were determined by the petrifilm and VIDAS SET2 methods, respectively. Staphylococcus spp. was isolated and evaluated for antimicrobial susceptibility and the presence of resistance genes tet(L), sul1, sul2, ermB, tetM, GN, tetW and strA. The sequencing results showed 501 Amplicon Sequence Variants (ASV), with 429 ASV corresponding to milk samples and 72 ASV to cheese samples. The Chao1 and Shannon indices showed that bacterial diversity in cheese samples was lower than in milk samples. Milk samples showed the presence of 87 genera, including Phyllobacterium spp. (42.59%), Staphylococcus spp. (29.20%), Pseudomonas spp. (10.96%), Lactococcus spp. (5.10%) and Acinetobacter spp. (1.38%). In cheese samples, the most abundant genera were Streptococcus spp. (73.15%), Lactobacillus spp. (19.91%), Lactococcus spp. (2.46%) and Staphylococcus spp. (1.74%). Beta diversity analysis showed that there were significant differences in the structure of microbial communities between milk and cheese samples. With regard to the food safety study, it was possible to observe a higher count of microorganisms in samples of raw sheep's milk than in cheese. Regarding the occurrence of enterotoxins, it was observed in a milk sample. 39 isolates of Staphylococcus spp. (15 in cheese and 24 in raw sheep's milk). In 12.5% of raw sheep milk, S. aureus was identified and other species were identified: S. sciuri, S. simulans, S. lentus, S. pseudintermedius, S. chromogenes and S. warneri. Regarding the phenotypic profile of antimicrobial resistance, 90% of the isolates showed resistance to at least one antimicrobial agent evaluated, and multidrug resistance was detected in strains of S. aureus, S. pseudintermedius and Staphylococcus coagulase-negative. For the resistance genes, 82% of the isolates carried out the tetM gene, 59% the ermB, 36% the strA, 28% the tetL, 23% the sul1 gene and 3% GN and sul2. The tetW gene was not detected in any isolate. These findings impact the dairy industry, which poses a risk to public health. The results contribute to the structuring of strategies that guarantee product quality and safety. Furthermore, these data can serve as a basis for the elaboration of specific legislation for both sheep's milk and cheese produced in Brazil.