Determinação de proteína de soja em produtos cárneos e embutidos por Clae-EM/EM

Abstract

A proteína de soja é industrialmente utilizada em diversos tipos de produtos cárneos e embutidos, por conferir características físico-químicas interessantes aos alimentos processados. A grande disponibilidade dos derivados de soja e seu baixo valor agregado tornam-se atrativos para a atuação de fraudadores. Além do prejuízo na qualidade do produto final, a adulteração com proteína de soja pode causar problemas de saúde pública, visto que a soja está dentre os 8 tipos de alimento que mais causam reações alérgicas no mundo. Portanto, é de grande importância manter a fiscalização a fim de evitar fraudes. Este trabalho teve como objetivo o desenvolvimento e validação de uma metodologia analítica capaz de determinar proteína de soja em produtos cárneos e embutidos, visando sua implementação na rotina de Fiscalização Federal de Produtos de Origem Animal do MAPA. Além disso, foi avaliada uma possível correlação entre o teor de proteínas e de isoflavonas. O método desenvolvido focou em atender à demanda da Fiscalização Federal com protocolos adequados à rotina laboratorial nos quesitos de custo e tempo de análise. A técnica analítica utilizada foi cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massa em modo tandem (CLAE-EM/EM) com ionização por electrospray. Foi utilizado um protocolo de análise do tipo “shotgun”, que consistiu em extrair as proteínas de interesse da matriz, digerí-las com enzima tripsina e analisar os peptídeos HFLAQSFNTNEDIAEK, EAFGVNMQIVR e FYLAGNQEQEFLK, marcadores da soja. O método desenvolvido foi capaz de detectar com segurança a presença dos analitos em concentrações a partir de 0,50 % (m/m) em diversas matrizes cárneas, atendendo ao objetivo de confirmar a presença de proteína de soja em produtos cárneos e embutidos. O peptídeo EAFGVNMQIVR na transição m/z = 632,3/760,4 foi utilizado como pico qualificador. Para fins quantitativos, o método desenvolvido foi validado para a matriz linguiça, utilizando padronização externa com amostras fortificadas (spiked). A exatidão foi avaliada em amostras de linguiça fortificadas com proteína isolada de soja. A faixa de trabalho estabelecida foi de 0,63 a 4,74 %, com limite de quantificação de 0,63 %. O peptídeo FYLAGNQEQEFLK foi utilizado como pico quantificador na transição m/z = 793,9/283,1. A segunda transição mais intensa (m/z = 793,9/424,2) foi utilizada como pico qualificador. Foi observado que a utilização de amostras fortificadas (spiked) na curva analítica subestima os resultados ao quantificar amostras reais (que contêm proteína incurred). Esse fenômeno ocorre devido aos processamentos sofridos pelas amostras ao longo da cadeia produtiva, que modificam a estrutura das proteínas e dificultam sua solubilidade e capacidade de extração. Por essa razão, ajustes são necessários para viabilizar a aplicação do método quantitativo desenvolvido em amostras reais. Uma alternativa proposta é preparar a curva analítica com amostras do tipo incurred de concentração conhecida.

Soy protein is commonly used industrially in many meat products, mainly because of the interesting physical properties it provides. Soy’s products large availability and low commercial value turns it very attractive to fraudsters’ actions. Further than the loss on quality of the product, the adulteration with soy protein may also cause public health’s issues, since soy is one of the 8 most allergenic kinds of food worldwide. For that reason, the continued inspection is essential to avoid frauds. The objective of this work was the development and validation of an analytical methodology to determinate soy protein in processed meat products, aiming at their implementation on Federal Inspection routines of the Ministry of Agriculture, Livestock and Food Supply’s laboratories. Besides, a correlation between the protein and isoflavone content was evaluated. The developed methods focused on attending the demand of Federal Inspection, with analytical protocols suitable for the daily laboratory routine, keeping lower cost and analysis time. The analytical technique used was liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) with electrospray ionization (ESI). The shotgun approach developed consisted in extracting the proteins of the matrix, digest them with trypsin and then analyze the chosen soy marker peptides HFLAQSFNTNEDIAEK, EAFGVNMQIVR e FYLAGNQEQEFLK. The developed qualitative method was capable of safely detect the presence of the analites in concentrations as from 0.50 % (m/m) in many meat products tested, fulfilling the objective to confirm the presence of soy protein in processed meat products. The peptide EAFGVNMQIVR was chosen as qualifier peak (transition m/z = 632.3/760.4). For quantitative purposes, the developed method was validated for the matrix sausage, using a spiked external standard calibration curve. Trueness was evaluated in sausage samples spiked with soy protein isolate. The working range was stablished from 0.63 to 4.74 %, with limit of quantification of 0.63 %. The two ost intense transitions of the peptide FYLAGNQEQEFLK was chosen as quantifier peak (m/z = 793.9/283.1) and qualifier peak (m/z = 793.9/424.2). It was observed that the spiked external standard calibration curve underestimates the results when used to quantify real samples. It occurs due to the processing effects suffered by the samples during their industrial production, wich modifies the protein structure and dificults its solubility and extractability. For that reason, some adjustments are necessary in order to apply the quantitative developed methodology in real samples. An alternative proposed was to prepare the external standard calibration curve with incurred samples with known concentration of soy protein.