O papel dos análogos do GLP-1 na função de ilhotas pancreáticas e na morte encefálica

Abstract

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é caracterizado pela destruição autoimune das células-beta pancreáticas, o que causa a deficiência total da produção de insulina e a necessidade de administração de insulina exógena para a sobrevivência. A terapia intensiva com insulina é capaz de reduzir o surgimento e a progressão das complicações crônicas do diabetes. Entretanto, as hipoglicemias severas associadas a este tratamento constituem um grave efeito colateral, especialmente em uma fração dos pacientes com DM1 que apresentam controle metabólico instável e episódios frequentes de hipoglicemias graves sem sintomas adrenérgicos de alerta. Para estes pacientes, o transplante de ilhotas pancreáticas é uma terapia efetiva em restabelecer a secreção de insulina, controle glicêmico e a percepção das hipoglicemias. No entanto, ao longo do processo do isolamento de ilhotas do pâncreas de um doador em morte encefálica (ME) e posterior enxerto no receptor ocorrem perdas importantes no número e qualidade das ilhotas, as quais impactam o desfecho do transplante. Dessa forma, frequentemente, são necessários transplantes de ilhotas de dois ou mais doadores para se atingir a independência à insulina, limitando o número de pacientes que podem se beneficiar dessa terapia. Neste contexto, diversos estudos têm buscado desenvolver estratégias capazes de minimizar a perda das ilhotas durante o isolamento ou cultura das ilhotas a serem transplantadas. As ilhotas são mantidas em cultura por até três dias antes do transplante, período no qual são realizados testes de viabilidade, função, esterilidade, pureza e contagem do número de ilhotas (islet equivalents – IEQs). Diversos estudos avaliaram se o uso de diferentes aditivos no meio de cultura ou cultura das ilhotas sobre componentes da matriz extracelular (ECM) ou outros dispositivos (scaffolds) foi capaz de melhorar 15 desfechos das ilhotas, com resultados bastante variados. Sendo assim, no nosso primeiro artigo, realizamos uma revisão sistemática com o objetivo de sumarizar os resultados desses estudos nos seguintes desfechos: IEQs, viabilidade e função (índice de estimulação de secreção de insulina - SI) das ilhotas. A busca foi feita nos sites PubMed e Embase e 37 artigos preencheram os critérios de elegibilidade e foram incluídos na revisão sistemática. Após a extração dos dados, esses artigos foram divididos nos seguintes grupos: 1) “antiapoptótico/anti-inflamatório/antioxidante”; 2) “hormônios”; 3) “sulfoniluréias”; 4) “soro”; e 5) “scaffolds ou componentes da ECM”. De uma forma geral, aditivos do grupo "antiapoptóticos/anti-inflamatórios/antioxidantes” parecem diminuir a apoptose das ilhotas e melhorar o SI, calculado após estimulação com concentrações normal e alta de glicose. Além disso, a cultura de ilhotas em scaffolds ou sobre componentes de ECM foi capaz de melhorar o SI. Os efeitos dos outros grupos de aditivos sobre os desfechos analisados foram heterogêneos, tornando difícil uma conclusão. Dessa forma, novos estudos são necessários para definir o real impacto desses aditivos na qualidade das ilhotas isoladas e nos desfechos do transplante. A avaliação da viabilidade das ilhotas é um critério importante para a liberação dessas células para transplante. O teste atualmente utilizado para a avaliação da viabilidade pela maioria dos centros de transplante é a coloração com acetado de fluoresceína (FDA) / iodeto de propídeo (PI). Entretanto, esta técnica apresenta algumas limitações, sendo dependente da experiência dos pesquisadores que vão estimar a porcentagem de células vivas (marcadas pela fluorescência verde – FDA) e mortas (fluorescência vermelha – PI) por ilhota. Neste contexto, um método quantitativo pode ser mais adequado para determinar a viabilidade das ilhotas. Então, no nosso segundo artigo, comparamos a viabilidade das ilhotas estimada com a coloração FDA/PI com 16 aquela obtida pela citometria de fluxo, usando-se o fluoróforo 7-Aminoactinomycin D (7AAD) e o anticorpo Anexina V-APC. Ilhotas isoladas de 10 ratos Wistar machos foram usadas para avaliar a viabilidade pelas duas técnicas. Na coloração FDA/PI, 50 ilhotas por animal foram analisadas por dois pesquisadores em um microscópio de fluorescência e, então, calculou-se a viabilidade média para as 50 ilhotas/experimento. Para a citometria de fluxo, as ilhotas foram primeiramente dissociadas. Após, 100.000 células dissociadas por animal foram incubadas com 7AAD (marcador de células necróticas ou apoptóticas tardias) e Anexina V-APC (marcador de células em apoptose precoce) e avaliadas no citômetro FACSCanto II. Uma correlação moderada foi encontrada entre as médias de viabilidade obtida pelas duas técnicas (r= 0,6, p= 0,047). A média da viabilidade medida pela citometria de fluxo foi mais alta do que a média estimada pela coloração FDA/PI (95,5 ± 1,4% vs. 89,5 ± 5,0%; p= 0,002), também demonstrando uma menor variação entre os experimentos. Embora a citometria de fluxo seja mais cara e mais demorada do que a coloração FDA/PI, é uma técnica quantitativa e não subjetiva. Sendo assim, deve ser a técnica de escolha para uma determinação mais eficaz da viabilidade das ilhotas. Muitos estudos demonstraram que os análogos do glucagon-like peptide-1 (GLP-1), como a exenatida (EXE) e liraglutida (LIRA), possuem propriedades anti-inflamatórias, pró-proliferativas e antiapoptóticas em células-beta. A adição de EXE ao meio de cultura das ilhotas parece ser capaz de melhor a viabilidade e o SI de ilhotas humanas. No nosso terceiro artigo buscamos confirmar se a adição de EXE ou LIRA ao meio de cultura das ilhotas isoladas de ratos melhora a viabilidade e função dessas células, protegendo-as de danos inflamatórios decorrentes do isolamento e cultura. Para isto, ilhotas isoladas de ratos Wistar machos foram cultivadas nas seguintes condições, por 72h: 1) Controle; 2) Pool de citocinas pró-inflamatórias (TNF, IFN-γ e IL-1β; adicionadas nas últimas 48h de cultura); 3) EXE; 4) EXE + citocinas; 5) LIRA; e 6) LIRA + citocinas. Após 72h de cultura, foram avaliados o SI e a viabilidade das ilhotas, a qual foi quantificada por citometria de fluxo, utilizando-se 7AAD/Anexina V-APC. O tratamento com EXE melhorou o SI das ilhotas submetidas à inflamação (grupo 4) comparado ao grupo tratado somente com citocinas (grupo 2): 1,21 ± 0,40 vs. 0,60 ± 0,22 (p= 0,037). Já a LIRA não influenciou o SI das ilhotas na presença ou ausência de citocinas (p= 0,469). A viabilidade das ilhotas não foi modificada pela presença de EXE ou LIRA (p >0,05). Em conclusão, a EXE parece possuir um papel protetor sobre a função das ilhotas de ratos frente a um estresse inflamatório direto. Estamos realizando experimentos adicionais de expressão gênica para avaliar por quais mecanismos essa melhora do SI acontece. Um estudo prévio do nosso grupo demonstrou que a administração de EXE a ratos com morte encefálica (ME) foi capaz de aumentar a viabilidade e o SI das ilhotas isoladas. Esses efeitos foram devidos a modificações em genes relacionados ao estresse oxidativo, estresse do retículo endoplasmático e inflamação. Sendo assim, hipotetizamos que a administração de EXE a doadores de órgãos em ME poderia melhorar a qualidade das ilhotas humanas para transplante. Entretanto, antes que isso possa ser testado, precisa-se demonstrar que esse hormônio também melhora (ou pelo menos não piora) parâmetros associados a outros órgãos a serem doados. Recentemente, relatamos que a administração de EXE a ratos com ME também melhora marcadores de dano hepático (aspartato aminotransferase e lactato desidrogenase), também reduzindo a apoptose dos hepatócitos. Na presente tese, avaliamos se o tratamento com EXE também pode diminuir danos renais após o desenvolvimento da ME em ratos. Ratos Wistar machos foram divididos em três grupos: 1) controle (sem lesão do sistema nervoso central); 2) ME (morte encefálica induzida experimentalmente); e 3) ME+EXE 18 (ME induzida experimentalmente, seguido pela administração intraperitoneal imediata de EXE). A partir das amostras de rins coletadas após 6h de ME, realizou-se a extração de RNA total e proteínas. Também se avaliou os níveis plasmáticos de um marcador de dano renal (creatinina). Ratos tratados com EXE tiveram níveis menores de creatinina comparado aos controles (p 0.05). A ME induziu estresse oxidativo nos rins através do aumento da expressão de Ucp2, Sod2 e Inos, enquanto a administração de EXE foi capaz de reduzir a expressão desses genes. A ME também aumentou a expressão de Tnf e do inflamasoma Nlrp3 comparado aos controles (p 0.05), mas a EXE não teve nenhum efeito na expressão desses genes (p 0.05). Além disso, o tratamento com EXE aumentou a expressão de Bcl2, um gene antiapoptótico. As expressões de Il-1β, IL-6 e Nfkb1a foram similares entre os grupos. Conclui-se que a administração de EXE a ratos com ME pode reduzir danos renais induzidos pela ME através da diminuição da expressão de genes relacionados ao estresse oxidativo e aumento de Bcl2.

Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is characterized by the autoimmune destruction of pancreatic beta-cells, which causes a total deficiency in insulin production and the requirement of exogenous insulin administration for survival. Intensive insulin therapy is able to reduce the onset and progression of diabetic chronic complications. However, the severe hypoglycemia episodes associated with this treatment are a serious side effect, especially in a fraction of T1DM patients who have unstable metabolic control and frequent episodes of severe hypoglycemia without adrenergic warning symptoms. For these patients, pancreatic islet transplantation is an effective therapy for restoring insulin secretion, glycemic control and hypoglycemia awareness. Nevertheless, during islet isolation from a pancreas of a donor with brain death (BD), and subsequent graft in the recipient, there are significant losses in the number and quality of the islets, which affect transplantation outcomes. Thus, islet transplantations from two or more donors are required to achieve insulin independence, limiting the number of patients who may benefit from this therapy. In this context, many studies have sought to develop strategies to minimize islet losses during isolation and culture. Islets are kept in culture for up to three days prior to transplantation, period in which are performed tests for islet viability, function, sterility, purity, and quantification of islet equivalent (IEQ) numbers. Several studies have evaluated if the use of different additives in the culture medium or islet culture on extracellular matrix (ECM) components or other devices (scaffolds) was able to improve islet outcomes, with quite different results. Thus, in our first article, we performed a systematic review aiming to summarize the results of these studies regarding the following outcomes: IEQs, viability and function (stimulation index - SI). PubMed and Embase repositories were searched, 20 and 37 articles met the eligibility criteria and were included in the systematic review. After data extraction, these articles were divided into the following groups: 1) "antiapoptotic/anti-inflammatory/antioxidant"; 2) "hormones"; 3) "sulfonylureas"; 4) "serum"; and 5) "scaffolds or ECM components". In general, additives of the "antiapoptotic/anti-inflammatory/antioxidant" group seem to decrease islet apoptosis and improve SI, which is calculated after stimulation with normal and high glucose concentrations. In addition, culturing islets on scaffolds or ECM components was able to improve SI. The effects of the other groups of additives on the analyzed outcomes were heterogeneous, making a conclusion difficult. Thus, new studies are needed to define the real impact of these additives on the quality of isolated islets and transplantation outcomes. Islet viability assessment is an important criterion for the release of these cells for transplantation. The currently islet viability test used by the majority of the Transplant Centers is the fluorescein diacetate (FDA) / propidium iodide (PI) staining. However, this technique has some limitations, being dependent on the experience of the researchers that will estimate the percentage of live (dyed by green fluorescence - FDA) and dead (red fluorescence - PI) cells per islet. In this context, a quantitative method may be more appropriate to determine islet viability. Thus, in our second article, we compared the islet viability estimated using FDA/PI staining with that obtained by flow cytometry, using the 7-Aminoactinomycin D (7AAD) fluorophore and the Annexin V-APC antibody. Islets isolated from 10 male Wistar rats were used to assess viability by the two techniques. After FDA/PI staining, 50 islets per animal were analyzed by two researchers in a fluorescence microscope and, then, the mean viability for 50 islets/experiment was calculated. For flow cytometry, islets were first dissociated. Afterwards, 100,000 dissociated cells per animal were incubated with 7AAD (dyes 21 necrotic or late apoptotic cells) and Annexin V-APC (identifies early apoptotic cells) and evaluated on the FACSCanto II cytometer. A moderate correlation was found between mean islet viability obtained by the two techniques (r= 0.6, P= 0.047). The mean viability measured by flow cytometry was higher than the mean viability estimated by FDA/PI staining (95.5 ± 1.4% vs. 89.5 ± 5.0%, P= 0.002), also showing lower variation among experiments. Although flow cytometry is more expensive and time-consuming than FDA/PI staining, it is a quantitative rather than a subjective technique. Therefore, it should be the technique of choice for a more effective determination of islet viability. Many studies have shown that glucagon-like peptide-1 (GLP-1) analogs, such as exenatide (EXE) and liraglutide (LIRA), have anti-inflammatory, proproliferative and antiapoptotic properties in beta-cells. The addition of EXE to the islet culture medium seems to improve both viability and SI of human islets. In our third article, we evaluated whether the addition of EXE or LIRA to the culture medium of islets isolated from rats improves viability and function of these cells, protecting them from the isolation and culture-related inflammatory damage. For this, islets isolated from male Wistar rats were cultured under the following conditions, for 72h: 1) Control; 2) Pool of proinflammatory cytokines (TNF, IFN-γ and IL-1β, added in the last 48h of culture); 3) EXE; 4) EXE + cytokines; 5) LIRA; and 6) LIRA + cytokines. After 72h of culture, we evaluated SI and islet viability, which was measured by flow cytometry using 7AAD/Annexin V-APC. EXE treatment improved the SI of islets submitted to inflammation (group 4) compared to the group treated only with cytokines (group 2): 1.21 ± 0.40 vs. 0.60 ± 0.22 (P= 0.037). However, LIRA did not influence SI of islets in the presence or absence of cytokines (P= 0.469). Islet viability was not modified by the presence of EXE or LIRA (P >0.05). In conclusion, EXE seems to play a protective role on islet function against a direct inflammatory stress. We are conducting additional gene expression experiments to evaluate by which mechanisms this improvement of SI occurs. A previous study from our group demonstrated that the administration of EXE to rats with brain death (BD) was able to increase viability and SI of the isolated islets. These effects were due to modifications in genes related to oxidative stress, endoplasmic reticulum stress and inflammation. We therefore hypothesized that EXE administration to organ donors with BD could improve the quality of human islets for transplantation. However, before this can be tested, it needs to be demonstrated that this hormone also improves (or at least does not worsen) parameters associated with other organs to be donated. We have recently reported that EXE administration to rats with BD also improves liver damage markers (aspartate aminotransferase and lactate dehydrogenase), also reducing hepatocyte apoptosis. In the present thesis, we evaluated whether EXE treatment may also decrease renal damage after the development of BD in rats. Male Wistar rats were divided into three groups: 1) control (without central nervous system injury); 2) BD (experimentally induced ME); and 3) BD + EXE (experimentally induced BD, followed by immediate intraperitoneal administration of EXE). Total RNA and proteins were extracted from kidney samples collected after 6h of ME. Plasma levels of a renal damage marker (creatinine) were also evaluated. Rats treated with EXE had lower creatinine levels compared to controls (P <0.05). BD induced oxidative stress in kidneys by increasing the expression of Ucp2, Sod2 and Inos, while EXE administration was able to reduce the expression of these genes. BD also increased Tnf and Nlrp3 inflammasome expression compared to controls (P <0.05), but EXE had no effect in the expression of these genes (P >0.05). In addition, EXE treatment increased expression of Bcl2, an antiapoptotic gene. Expressions of IL-1β, IL- 23 6 and Nfkb1a were similar between groups. In conclusion, the administration of EXE to BD rats might reduce BD-induced renal damage by decreasing expressions of oxidative stress-related genes and increasing Bcl2.