Desenvolvimento de nanocompósitos contendo nisina como embalagens para alimentos e avaliação da sua toxicidade aguda

Abstract

Novas estruturas nanométricas vêm sendo desenvolvidas e estudadas para aplicação em várias áreas, inclusive na indústria de alimentos. No presente estudo, foram desenvolvidos lipossomas de fosfatidilcolina purificada (Phospholipon®) e semi- purificada a partir de lecitina de soja, contendo o peptídeo antimicrobiano nisina. Esses lipossomas foram caracterizados através de seu tamanho, polidispersividade, potencial zeta, eficiência de encapsulação e estabilidade. Lipossomas com 1,0 mg/ml de nisina, feitos de Phospholipon® apresentaram maior estabilidade e eficiência de encapsulação, sendo selecionados para incorporação em filmes nanocompósitos contendo 0,5g/l da nanoargila haloisita e biopolímeros (gelatina e caseína). Esses filmes foram caracterizados quanto a propriedades antimicrobianas, estruturais, mecânicas, térmicas e ópticas. Os filmes inibiram as bactérias Gram-positivas Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens e Bacillus cereus. A adição de lipossomas e haloisita aumentou a rugosidade dos filmes e diminuiu a temperatura de transição vítrea. A espectroscopia infravermelho evidenciou que não houve interações químicas entre os lipossomas e haloisita com a matriz protéica. Os filmes de caseína se mostraram mais finos e amarelados, mais rígidos e menos elásticos quando comparados aos filmes de gelatina. Para realizar uma avaliação da toxicidade aguda dos componentes nanométricos presentes nos filmes, foi utilizado o nemátodo Caenorhabditis elegans como modelo biológico. Foram avaliados os parâmetros dose letal mediana (DL50), desenvolvimento dos vermes, peroxidação lipídica, produção de espécies reativas de oxigênio (ERO) e produção das enzimas catalase e superóxido dismutase. A nisina livre apresentou a menor DL50 entre os componentes do presente estudo (0,239 mg/ml) e promoveu a diminuição do tamanho corporal dos vermes nessa concentração. A taxa de sobrevivência em lipossomas controle (contendo apenas tampão fosfato) e lipossomas contendo nisina foi de 94,3 e 73, 6%, respectivamente, sugerindo que os lipossomas podem ser considerados sistemas não-tóxicos para aplicação em alimentos. Foram também testadas as nanorgilas haloisita, bentonita e montmorilonita modificada com octadecilamina, puras e com nisina adsorvida. A haloisita foi a argila menos tóxica, com DL50 8,38 mg/ml, ao passo que a montmorilonita modificada com octadecilamina foi a mais tóxica, com DL50 0,35 mg/ml. A adsorção de nisina à haloisita e bentonita provocou uma grande diminuição na sobrevivência dos vermes, o que não ocorreu com a montmorilonita modificada com octadecilamina. Todas as argilas alteraram em algum grau o desenvolvimento dos vermes, sendo mais pronunciado no tratamento com bentonita. Todos os componentes testados provocaram aumento nos níveis de espécies reativas de oxigênio e alterações nas quantidades de CAT e SOD. A peroxidação lipídica foi detectada apenas em vermes expostos à montmorillonita modificada com octadecilamina, em doses maiores que a DL50. O teste de Spearman demonstrou que a taxa de morte e o nível de ERO estão positivamente correlacionados, sugerindo que o provável mecanismo de toxicidade é o estresse oxidativo.

New nanoscale structures have been developed and studied for use in many areas, including food industry. In the present study, were developed liposomes made of purified(Phospholipon®) and semi-purified phosphatidylcholine, containing the antimicrobial peptide nisin. These liposomes were characterized by their size, polydispersity, zeta potential, encapsulation efficiency and stability. Liposomes with 1.0 mg/ml of nisin, made of Phospholipon® showed greater stability and encapsulation efficiency and were selected for incorporation in nanocomposite films containing 0.5 g/ l of halloysite nanoclay and biopolymers (gelatin and casein). These films were characterized for antimicrobial properties, structural, mechanical, thermal and optical. The films inhibited Gram-positive bacteria Listeria monocytogenes, Clostridium perfringens and Bacillus cereus. The addition of liposomes and halloysite increased roughness of the films and decreased the glass transition temperature. The infrared spectroscopy showed that no chemical interactions occurred between the liposomes and halloysite with the protein matrix. The casein films were thinner, yellowish, more rigid and less elastic compared to gelatin films. To evaluate the acute toxicity of nanometric components present in the films, we used the nematode Caenorhabditis elegans as biological model. Were evaluated the parameters median lethal dose (LD50), development of worms, lipid peroxidation, production of reactive oxygen species (ROS) and production of enzymes catalase and superoxide dismutase. The free nisin showed the lowest LD50 among the components of this study (0.239 mg/ml) and promoted decrease in body size of the worms at this concentration. The survival rate in control liposomes (containing only phosphate buffer) and liposomes containing nisin was 94.3 and 73 6%, respectively, suggesting that the liposomes may be considered non-toxic for use in food systems. The nanoclays halloysite, bentonite and montmorillonite modified with octadecylamine, pure and with adsorbed nisin were also tested. Halloysite was less toxic nanoclay, with LD50 8.38 mg/ml, whereas the montmorillonite modified with octadecylamine was more toxic with LD50 0.35 mg/ml. The adsorption of nisin to halloysite and bentonite caused a large decrease in the survival of worms, which did not occur with the montmorillonite modified with octadecylamine. All nanoclays altered in some degree the development of the worms, but it was more pronounced in treatment with bentonite. All tested components caused increased levels of reactive oxygen species and changes in amounts of CAT and SOD. Lipid peroxidation was detected only in worms exposed to montmorillonite modified with octadecylamine, at doses higher than the LD50. Spearman's test showed that the death rate and the level of ROS are positively correlated, suggesting that the probable mechanism of toxicity is oxidative stress.