Glicobiologia estrutural da modulação da cascata de coagulação sanguínea por heparina

Abstract

Antitrombina (AT), uma proteína membro da família dos inibidores de serino proteases, é uma glicoproteína que co-existe em duas isoformas, a e b, que se diferenciam pelo conteúdo de glicosilação e pela afinidade por glicosaminoglicanos (GAG), um grupo de polissacarídeos polisulfatados, dentre as quais se destaca a heparina. AT é ativada quando ligada a GAGs, tornando-se assim capaz de inibir, com alta eficiência, proteases da cascata de coagulação como trombina e fXa. Essas enzimas formam complexos ternários com heparina e AT, sendo cada uma subsequentemente inibidas preferencialmente por um mecanismo de ação distinto: [1] baseado em mudanças conformacionais (fXa), ou pelo [2] mecanismo de ponte (trombina). Adicionalmente, já foi observado que heparina isoladamente pode modular a atividade catalítica de fIIa e fXa. Considerando a falta de dados estruturais a respeito dos efeitos da glicosilação sobre a estrutura e flexibilidade de AT, bem como sobre o reconhecimento heparina-AT, e que as bases moleculares da inibição alostérica de fIIa e fXa por GAGs não é bem compreendida, o presente trabalho visa caracterizar o reconhecimento molecular de heparina por essas proteínas, através de dinâmica molecular (DM). Os resultados obtidos indicam que a heparina interage de forma diferente nas glicoformas de AT devido a uma interferência da glicana ligada à Asn135. Da mesma forma, diferentes arranjos do GAG na superfície de trombina e fXa podem estar relacionadas às suas diferentes susceptibilidades aos mecanismos de ação de heparina, uma vez que sua orientação na superfície de fIIa, mas não fXa, permite uma interação adequada com AT em complexos ternários. Nesse contexto, foi observado, durante as simulações, que heparina inibiu alostericamente trombina e fXa, promovendo mudanças na conformação da tríade catalítica das proteases, e ativou AT, promovendo rearranjos intramoleculares entre seus elementos de estrutura secundária. Em ambos os casos, as vias de transmissão de sinal associadas a essas mudanças de atividade foram traçadas pela primeira vez nesse trabalho. De forma geral, os resultados obtidos conferem novas evidências de que a glicosilação tem um papel crucial na ativação diferencial de a- e b-AT por heparina, e que a orientação de GAGs na superfície de trombina e fXa é o que determina o mecanismo de sua modulação por heparina.

Antithrombin (AT), a member of the serpin protease inhibitors family, is a glycoprotein that co-exists in two isoforms, a and b, which differ in their amount of glycosylation and affinity for glycosaminoglycans (GAG), a group of sulphated polysaccharides, as heparin. AT is activated when bound to GAGs, becoming capable to inhibit coagulation cascade serine proteases like thrombin and fXa. Such enzymes form ternary complexes with heparin and AT, being subsequently inhibited by two distinct mechanisms of action: [1] the conformational change-based mechanism or the [2] bridge mechanism. In addition, heparin binding itself was also observed to modulate the catalytic activity of both fIIa and fXa. Considering the lack of structural information regarding the effect of glycosylation over the structure and flexibility of AT, as well as in heparin-AT recognition, and that the molecular basis of the allosteric inhibition of fIIa and fXa, promoted by such GAG, is not fully understood, the current work intends to characterize the molecular recognition of heparin by such proteins through molecular dynamics (MD) simulations. The obtained results indicate that heparin binds differently on AT glycoforms due to an interference of Asn135-linked glycan. As well, distinct arrangements of the polysaccharide on the surface of thrombin and fXa may be related to their diverse susceptibilities to heparin mechanisms of action, as heparin orientation observed on the surface of fIIa, but not fXa, allows for an adequate long chain heparin binding to AT in ternary complexes. In this context, heparin was observed to allosterically inhibit thrombin and fXa by promoting changes in the proteases catalytic triad conformation, but to activate AT by promoting intramolecular rearrangements on its secondary structure elements. In both cases, the signal transmission pathways associated with such activity changes were traced by the present work for the first time. Altogether, the obtained results provide new evidences that glycosylation play a central role on the differential activation of a- and b-AT by heparin, and that GAGs orientation on the surface of thrombin and fXa determine the mechanism of their modulation by heparin.