Validação de biossensor fluorescente da razão intracelular ATP : ADP em células vivas

Abstract

O status energético do metabolismo celular é responsável por regular a atividade de diversas enzimas envolvidas em diferentes processos celulares, como a divisão celular. A hidrólise da molécula de adenosina 5’-trifosfato (ATP) é a principal fonte de energia pelas células, sendo que sua concentração fisiológica impacta diretamente na atividade metabólica e no comportamento celular. Em condições fisiológicas, o processo de obtenção de ATP se inicia pela via glicolítica, que é responsável por oxidar a molécula de glicose e, posteriormente, enviar seus metabólitos para a cadeia transportadora de elétrons - a principal via de obtenção de moléculas de ATP. No entanto, em células proliferativas e em células tumorais, a glicólise se torna a principal fonte de obtenção de ATP - uma reprogramação metabólica, denominada efeito Warburg, já bem descrita em tumores. Neste contexto, este trabalho foi proposto como uma forma de validar o uso de um biossensor fluorescente repórter da razão intracelular ATP:ADP, o GW1CMV-Perceval, e verificar sua funcionalidade em células de linhagens celulares de glioblastoma humano por meio da expressão transiente do vetor e de diferentes métodos de análises de fluorescência. Os dados preliminares apresentados demonstram a funcionalidade do sensor em diferentes linhagens celulares (normal e tumoral) e sugerem a capacidade do plasmídeo em medir alterações na razão intracelular ATP:ADP induzidas por tratamentos com inibidores da via glicolítica e da fosforilação oxidativa a nível populacional e de células únicas - sendo uma potencial ferramenta para contribuir no estudo do metabolismo de células tumorais e do seu impacto na resistência aos tratamentos usuais.

The energetic status of cellular metabolism is responsible for regulating the activity of several enzymes involved in different cellular processes, such as cell division. The hydrolysis of the adenosine 5'-triphosphate (ATP) molecule is the main source of energy for cells, and its physiological concentration directly impacts metabolic activity and cellular behavior. Under physiological conditions, the process of obtaining ATP begins through the glycolytic pathway, which is responsible for oxidizing the glucose molecule and, subsequently, sending its metabolites to the electron transport chain - the main route for obtaining ATP molecules. However, in proliferative cells and tumor cells, glycolysis becomes the main source of obtaining ATP - a metabolic reprogramming, called the Warburg effect, already well described in tumors. In this context, this study was proposed to validate the use of a fluorescent biosensor reporter of the intracellular ATP:ADP ratio, the GW1CMV-Perceval, and verify its functionality in cells from human glioblastoma cell lines through transient expression of the vector and different fluorescence analysis methods. The preliminary data presented demonstrate the functionality of the sensor in different cell lines (normal and tumor) and suggest the ability of the plasmid to report changes in the intracellular ATP:ADP ratio induced by treatments with inhibitors of the glycolytic pathway and oxidative phosphorylation at a population level and in single cells - being a potential tool to contribute to the study of tumor cell metabolism and its impact on resistance to usual treatments.