Perfil metabólico de células humanas de adenocarcinoma de pulmão sensíveis e resistentes à cisplatina

Abstract

Lung cancer is the most prevalent cancer and the leading cause of death worldwide. The standard treatment of lung cancer is chemotherapy and cisplatin (CDDP) is one of the most used drug. Although CDDP resistance is frequent in lung cancer therapy. CDDP resistance is a complex and multifactorial event. Cell fitness and different bioenergetic trade-offs adopted by cells are examples of determinant factors in cancer resistance. Previous studies of our group identified possible bioenergetics alteration and change in cell growth strategies of CDDP- resistant cells. Thus, the present study evaluated the metabolic profile and regulation of bioenergetic pathways of CDDP-sensitive and -resistant cells. To that end, acquired CDDP- resistant cells (A549/CDDP) were developed by the exposure to increasing drug concentration of A549 parental cell line. Then, gene expression analysis of genes related to bioenergetic metabolism was performed by RT-qPCR. Energy sources dependence and effect of anti- and pro-oxidant agents were evaluated by proliferation or clonogenic assay. The effect of glycolytic inhibitors was accessed by cytotoxicity assay. Parameters of mitochondrial O2 consumption were evaluated by high-resolution respirometry. Expression of the initiation factor eIF2α and 4E-BP1, and their phosphorylated isoforms were analyzed by western blot. A549/CDDP cells showed a downregulation of genes involved in glucose and L-glutamine metabolism. Also, the glycolysis inhibitor TIGAR (TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator) was upregulated in A549/CDDP cells. These results suggest a reduction of glucose and L-glutamine metabolic pathways. Moreover, CDDP-resistant cells showed higher dependence of these substrates for cell proliferation. The glycolysis inhibitor 2-DG showed higher cytotoxicity in A549/CDDP cells, which may be a consequence of reduction in glycolytic enzymes. Furthermore, A549/CDDP cells presented lower mitochondrial respiration featuring decreased mitochondria activity. CDDP-sensitive and -resistant cells showed similar response to anti- and pro-oxidant agents, indicating a possible similarity in redox balance. Lastly, 4E-BP1 showed a reduction in the ratio of phosphorylated isoform 4E-BP1 (Thr37/46) to hypophosphorylated 4E-BP1 in A549/CDDP cells. Thereby, a possible global translation regulation in A549/CDDP cells may be acting as a CDDP-resistance mechanism. Together, this work describes a general reduction in metabolism in CDDP-resistant cells which may be a possible consequence of global translation reduction. Thus, A better understanding of these pathways in CDDP resistance may provide better prognosis and alternative treatments for lung cancer.

O câncer de pulmão é o tipo de câncer mais incidente e o líder em causas de morte em todo o mundo. O tratamento padrão para pacientes com câncer de pulmão é a quimioterapia, sendo a cisplatina (CDDP) uma das drogas mais utilizadas. Contudo, a resistência do câncer à CDDP é frequente. A resistência à CDDP é um processo complexo e multifatorial. O fitness celular e diferentes trade-offs bioenergéticos adotados pela célula são exemplos de fatores determinantes na resistência. Estudos prévios do grupo de pesquisa identificaram potenciais alterações bioenergéticas e estratégias de crescimento em células resistentes à CDDP. Portanto, o presente estudo avaliou o perfil metabólico e a regulação de vias bioenergéticas de células sensíveis e resistentes à CDDP. Para isso, células com resistência adquirida à CDDP (A549/CDDP) foram desenvolvidas a partir da exposição de células da linhagem parental A549 a concentrações crescentes da droga. Após, análise da expressão gênica de genes relacionados ao metabolismo foi realizada por RT-qPCR. A dependência por fontes energéticas e efeito de agentes anti- e pró-oxidantes foram avaliados por ensaio de proliferação ou clonogênico. O efeito de inibidores glicolíticos foi avaliado por ensaio de citotoxicidade. Parâmetros do consumo de O2 mitocondrial foram avaliados por respirometria de alta resolução. A expressão do fator de iniciação eucariótico eIF2α e de 4E-BP1 e a fosforilação destes foram avaliadas por western blot. Células A549/CDDP apresentaram regulação negativa de genes evolvidos com o metabolismo de glicose e L-glutamina, além da regulação positiva do inibidor de glicólise TIGAR (TP53-induced glycolysis and apoptosis regulator), indicando redução da atividade destas vias metabólicas. Também, células resistentes à CDDP apresentaram maior dependência à glicose e L-glutamina para a proliferação. O inibidor 2-DG apresentou maior citotoxicidade em células resistentes, sendo uma consequência da redução de enzimas glicolíticas. Além disso, células A549/CDDP apresentaram respiração mitocondrial reduzida, caracterizando menor atividade da mitocôndria. As linhagens apresentaram semelhança na resposta a agentes anti- e pró-oxidantes, indicando possível semelhança quanto ao equilíbrio redox. Por fim, 4E-BP1 apresentou uma redução na razão da isoforma fosforilada 4E-BP1 (Thr37/46) por 4E-BP1 hipofosforilada em células A549/CDDP. Assim, uma possível regulação global da tradução em células A549/CDDP pode estar atuando como um mecanismo de resistência. Em conjunto, este trabalho descreve uma redução geral do metabolismo em células resistentes à CDDP, possível consequência de uma redução global da tradução. Com isso, o melhor entendimento destas vias na resistência à CDDP poderá proporcionar melhores prognósticos e tratamentos alternativos para o câncer de pulmão.