Genomic, evolutionary, and functional analyses of terpene synthase genes in Psidium cattleyanum Sabine

Abstract

Psidium cattleyanum Sabine, commonly known as araçá, is a neotropical fruit tree with a remarkable ability to adapt to different environments. The species is divided into two morphotypes (individuals with morphological and/or colour variations). One of them has red fruit colour when ripe, while the other morphotype has yellow fruit. The species also stands out for having a polyploid complex, characterised by individuals containing varying numbers of chromosome sets (2n=3x=33 to 2n=12x=132). In addition to the variability in its DNA content and morphology, it also shows variation in the constitution of secondary metabolites. Previous studies have detected differences in the oil profile between yellow and red araçá and this may be due to different isolation techniques or the collection site. In the essential oil of araçá, terpenoids can be produced by primary metabolism and play essential roles in the growth and development of the plant. When produced by the secondary metabolism, these metabolites mediate interactions with pollinators and fungi, defend the plant against pathogens and herbivores, protect it from heat stress and play important ecological roles in plant-environment interaction. Due to their economic importance, great efforts have been made to investigate the molecular mechanisms that determine the structural diversity of terpene synthase (TPS) genes in dried capsular fruit species of the Myrtaceae family, which show functional versatility and high concentrations of leaf terpenes. These genes synthesize enzymes that catalyse condensation, cyclisation or rearrangements, converting the precursors geranyl diphosphate (GPP), neryl diphosphate (NPP) or farnesyl diphosphate (FPP) into mono- (C10), sesqui- (C15), di- (C20), tri- (C30), tetra- (C40) and polyterpenoids (with more than 40 carbon atoms). In Neotropical fruit species, the genetic influence on the production of essential oils is unknown. The aim of this thesis is to investigate the differences in the terpenoid biosynthesis pathway between the red and yellow morphotypes, as well as their biosynthesis in individuals with variations in DNA content, to understanding the diversification and adaptation of this plant, which is characterized by rapidly expanding natural environments, found in the tropics and subtropics, and considered invasive in some regions. In the first chapter, we identified and characterized the terpene synthase (TPS) gene family and explored the essential oil profile of red and yellow araçá. The TPS-b1 subfamily genes stand out for being responsible for the biosynthesis of monoterpenes, the majority compounds found in the oil profile of both morphotypes. Notably, the essential oil of red araçá was dominated by 1,8-cineol and linalool, while yellow araçá had a higher proportion of α-pinene. Gene expression analyses were carried out, indicating distinct expression patterns, suggesting genetic regulation influencing essential oil content. Finally, phylogenetic and selection analyses were carried out among Myrtaceae species to elucidate the mechanisms that explain the chemical variability of essential oil compounds, along with the evolution of the Myrteae tribe. In the second chapter, we explore single nucleotide polymorphism (SNP) markers in P. cattleyanum. Gene ontology analyses of DarTseq-derived sequences (STAGs) highlighted genetic variants associated with transcripts in pathways involved with terpene biosynthesis, underscoring their regulatory influence on adaptative traits of the species. In addition, we provide a collection of conserved, polymorphic, and functional markers specific for the genus. In the third chapter, we initiate cloning and enzyme assay studies on key genes in the terpene biosynthesis pathway. The findings of this research provide information on the genetic organization of terpene metabolism in araçá and possible roles in adaptation mechanisms in this neotropical fruit species, contributing to conservation and molecular breeding applications, especially in the context of climate change.

Psidium cattleyanum Sabine, comumente conhecido como araçá, é uma frutífera neotropical com notável capacidade de adaptação à diversos ambientes. A espécie é dividida em dois morfotipos (indivíduos com variações morfológicas e/ou cromáticas). Um deles apresenta coloração dos frutos vermelha quando em estado de maturação, enquanto o outro morfotipo exibe frutos de coloração amarela. A espécie também destaca-se por apresentar um complexo poliplóide, caracterizado por indivíduos contendo números variados de conjuntos cromossômicos (2n=3x=33 a 2n=12x=132). Além da variabilidade em seu conteúdo de DNA, e sua morfologia, apresenta variação na constituição de metabolitos secundários. Estudos anteriores detectaram diferenças no perfil de óleo entre o araçá amarelo e o vermelho e isso pode ser devido a diferentes técnicas de isolamento, ou ao local de coleta. No óleo essencial do araçá, os terpenóides podem ser produzidos pelo metabolismo primário e desempenham papéis essenciais no crescimento, e desenvolvimento da planta. Estes metabólitos quando produzidos pelo metabolismo secundário, medeiam interações com polinizadores e fungos, defendem a planta contra patógenos e herbívoros, protegem do estresse térmico, desempenhando importantes papéis ecológicos na interação planta-ambiente. Devido à sua importância econômica, foram realizados grandes esforços para investigar os mecanismos moleculares que determinam a diversidade estrutural dos genes da terpeno sintase (TPS) em espécies de frutos capsulares secos da família Myrtaceae, que apresentam versatilidade funcional e concentrações elevadas de terpenos foliares. Estes genes sintetizam enzimas que catalisam a condensação, ciclização, ou rearranjos, convertendo os precursores geranil difosfato (GPP), neril difosfato (NPP) ou farnesil difosfato (FPP) em mono (C10), sesqui- (C15), di- (C20), tri-(C30), tetra- (C40) e politerpenoides (com mais de 40 átomos de carbono). Nas espécies frutíferas neotropicais a influência genética na produção de óleos essenciais é desconhecida. Assim, a presente tese tem o objetivo de investigar as diferenças na via de biossíntese dos terpenoides entre os morfotipos vermelho e amarelo, bem como a sua biossíntese em indivíduos com variação no conteúdo de DNA, visando contribuir para a compreensão da diversificação e adaptação desta planta que caracteriza-se por expandir se rapidamente ambientes naturais, encontrada nos tropicos e subtropicos, considerada invasora em algumas regiões. No primeiro capítulo, identificamos e caracterizamos a família de genes terpeno sintase (TPS) e exploramos o perfil do óleo essencial do araçá vermelho e amarelo. Os genes da subfamília TPS-b1 destacam-se por serem responsáveis pela biossíntese de monoterpenos, compostos majoritários encontrados no perfil do óleo de ambos os morfotipos. Notavelmente, o óleo essencial do araçá vermelho foi dominado por 1,8-cineol e linalol, enquanto o araçá amarelo teve uma maior proporção de α-pineno. Foram realizadas análises de expressão gênica, que indicam padrões de expressão distintos, sugerindo regulação genética influenciando o conteúdo de óleo essencial. E por fim, análises filogenéticas e de seleção foram realizadas entre espécies de Myrtaceae, a fim de elucidar os mecanismos que explicam a variabilidade química dos compostos do óleo essencial, juntamente com a evolução da tribo Myrteae. No segundo capítulo, exploramos marcadores de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) em P. cattleyanum. As análises de ontologia genêtica das sequências deridadas de DarTseq (STAGs) ancoradas em transcritos revelaram variantes genéticas em vias enriquecidas associadas à biosíntese de terpenos, indicando a potencial influência regulatória dessas vias sobre características adaptativas no araçá. Além disso, foi possível obter um conjunto de marcadores conservados, polimórficos e funcionais para a espécie. No terceiro capítulo, iniciamos estudos de clonagem e ensaio enzimático em genes-chave da via de biossíntese dos terpenos. Os resultados desta pesquisa oferecem informações sobre a organização genética do metabolismo dos terpenos no araçá e possíveis papeis em mecanismos de adaptação nessa espécie frutífera neotropical, contribuindo para aplicações de conservação e melhoramento molecular, especialmente frente as mudanças climáticas.