Adaptação de vetores para uso no silenciamento de genes em arroz

Abstract

A sequência genômica proporciona grande riqueza de informações na predição de produtos gênico. Entretanto, somente as sequências não fornecem informações suficientes sobre a função dos genes no genoma. O sequenciamento de genoma de plantas modelo favorece o estudo da genômica funcional, fornecendo importantes informações sobre as possíveis participações de genes em processos biológicos. Diversas técnicas têm sido empregadas na análise funcional de genes in vivo, sendo o silenciamento gênico pós-transcrição (PTGS) uma destas. O presente trabalho tem como objetivo construir vetores com genes de arroz para otimização da técnica de PTGS. Para as construções, foi utilizado o vetor pLITIMUS 38i, no qual foram clonados os cDNAs de ferritina e de PDS. Os produtos da reação de ligação foram utilizados para transformação de E. coli XL1-Blue e HT115 (DE3) eletrocompetentes. Após a confirmação da inserção, foram produzidos dsRNAs in vivo e in vitro. Além disso, os dsRNAs de PDS produzidos in vitro foram utilizados para produção de siRNAs, em uma reação realizada pela RNase III. A produção de dsRNA in vitro mostrou-se mais eficiente do que a produção in vivo, com rendimentos de aproximadamente 100 μg e 1,7 μg por 10¹⁰ células de E. coli, respectivamente. No entanto, a última é mais adequada para análises em larga escala por seu baixo custo. Os vetores construídos nesse trabalho serão utilizados para a determinação de um método de silenciamento que permita a análise funcional de um grande número de genes, de forma rápida e com baixo custo.