Investigação da modulação do sistema purinérgico sobre a resposta celular a quimioterápicos em linhagens de câncer de bexiga

Abstract

O câncer de bexiga (CB) é um dos 10 tipos de câncer mais prevalentes em todo o mundo, e a segunda neoplasia urogenital mais comum, atinge principalmente indivíduos do sexo masculino e está relacionado com o tabaco e a idade avançada. O prognostico dos pacientes com CB é preocupante, visto que os tratamentos atuais não são eficazes, e permitem em muitos casos a reincidência do tumor. A sinalização purinérgica é controlada principalmente pela cascata enzimática envolvendo a família NTPDase/E-NPP e ecto-5'-nucleotidase/CD73, que hidrolisam adenosina trifosfato (ATP) extracelular em adenosina (ADO). Alguns trabalhos revelam alteração na expressão das enzimas NTPDase3 e CD73 durante a progressão do CB em camundongos. A ADO gerada da ação destas enzimas desempenha um importante papel no microambiente tumoral agindo como mediador imunossupressor promovendo a proliferação, angiogênese e resistência tumoral. O Bozepinib (BZP) é um interessante candidato a quimioterápico. Estudos mostram suas promissoras atividades farmacológicas, com destaque para sua potente e seletiva ação antitumoral e antimetastática in vitro e in vivo em câncer de mama, cólon, glioblastoma e melanoma. Nessa circunstância, um dos objetivos desse trabalho foi avaliar a ação citotóxica do BZP em linhagens de CB, e no sistema purinérgico. Nossos primeiros resultados, mostram que o BZP apresentou atividade citotóxicas em células de CB (RT4 e T24) com baixos valores de IC50 quando comparado a uma linhagem celular de fibroblasto humano (MRC-5). Vimos que o tratamento com o BZP induz morte celular por apoptose, com alteração na progressão do ciclo celular e com apenas três ciclos de tratamento as células T24 foram totalmente eliminadas. Além disso, o BZP foi capaz de modular o sistema purinérgico, aumentando a expressão e a atividade de hidrólise da enzima NPP1. Esses resultados mostram que o BZP apresenta uma interessante atividade contra linhagens de CB, porém mais estudos são necessários a fim de compreender o seu mecanismo de ação e toxicidade in vivo. Além disso, também decidimos verificar o envolvimento das enzimas NTPDase3 e CD73 na resistência ao tratamento com os Cisplatina (CIS), Gemcitabina (GEM) e Paclitaxel (PTX), principais quimioterápicos utilizados no CB. Para tanto, a NTPDase3 foi super expressa na linhagem T24, por transfecção com pcDNA3, e a CD73 foi silenciada utilizando o sistema CRISPR/Cas. Os clones de cada transfecção foram caracterizados mostrando o sucesso de ambas transformações genéticas. Os resultados mostram que a super expressão da NTPDase3 tornou a linhagem T24 mais resistente aos tratamentos, enquanto o silenciamento da CD73 deixou a linhagem mais sensível ao tratamento com GEM e PTX, enquanto se tornou mais resistente à CIS. Mais estudos são necessários para aprofundar o papel das enzimas purinérgicas na sensibilidade e/ou resistência aos quimioterápicos no tratamento do CB.

Bladder cancer (BC) is one of the 10 most prevalent types of cancer worldwide, and the second most common urogenital neoplasm, affects mainly males and is related to tobacco and advanced age. The prognosis of patients with BC is worrying, since current treatments are not effective, and in many cases allow tumor recurrence. Purinergic signaling is mainly controlled by the enzymatic cascade involving the NTPDase/E-NPP family and ecto-5'-nucleotidase/CD73, which hydrolyze extracellular adenosine triphosphate (ATP) into adenosine (ADO). Some proven works on the expression of NTPDase3 and CD73 enzymes during BC progression in mice. The ADO generated from the action of these enzymes plays an important role in the tumor microenvironment acting as an immunosuppressive mediator promoting anticipation, angiogenesis and tumor resistance. Bozepinib (BZP) is an interesting chemotherapy candidate. Studies show its promising pharmacological activities, highlighting its potent and selective antitumor and antimetastatic action in vitro and in vivo in breast, colon, glioblastoma and melanoma cancer. In this circumstance, one of the objectives of this work was to evaluate the cytotoxic action of BZP in BC cell lines, and in the purinergic system. Our first results show that BZP showed cytotoxic activity in BC cells (RT4 and T24) with low IC50 values when compared to a human fibroblast cell line (MRC-5). We saw that treatment with BZP induces cell death by apoptosis, with changes in cell cycle progression and with only three cycles of treatment the T24 cells were eliminated. Furthermore, BZP was able to modulate the purinergic system, increasing the expression and hydrolysis activity of the NPP1 enzyme. These results show that BZP has an interesting activity against BC cell lines, but more studies are needed in order to understand its mechanism of action and toxicity in vivo. In addition, we also discuss the verification of the involvement of NTPDase3 and CD73 enzymes in resistance to treatment with Cisplatin (CIS), Gemcitabine (GEM) and Paclitaxel (PTX), the main chemotherapeutics used in BC. For this purpose, NTPDase3 was overexpressed in the T24 cell line, by transfection with pcDNA3, and CD73 was silenced using the CRISPR/Cas system. Clones from each transfection were characterized showing the success of both genetic transformations. The results show that NTPDase3 overexpression made the T24 cell line more resistant to treatments, while CD73 silencing made the strain more sensitive to GEM and PTX treatment, while becoming more resistant to CIS. More studies are needed to deepen the role of purinergic enzymes in sensitivity and/or resistance to chemotherapy in the treatment of BC.