Efeitos da stanniocalcina 1 na viabilidade neuronal em um modelo de isquemia in vitro e em células SH-SY5Y indiferenciadas e diferenciadas

Abstract

A Stanniocalcina 1 (STC1) é um hormônio anti-hipercalcêmico em peixes e, em mamíferos, ela é um hormônio com funções endócrinas, parácrinas e autócrinas. Em mamíferos, a STC1 tem efeitos na regulação da homeostasia celular de cálcio (Ca2+) e fosfato inorgânico, no metabolismo, na diferenciação celular, na apoptose e no câncer. A STC1 também é considerada neuroprotetora por ser observado aumento da sua expressão no encéfalo de ratos após infarto-isquêmico. A isquemia é resultado de uma redução de fluxo sanguíneo aos tecidos. No encéfalo, a isquemia causa morte neuronal devido à incapacidade dos neurônios em manter a demanda de ATP e de conter o acúmulo de Ca2+ intracelular. A privação de oxigênio e glicose (POG) é um modelo de isquemia in vitro muito utilizado em culturas organotípicas de hipocampo. O neuroblastoma é um tumor pediátrico sólido extracranial, o qual possui propensão a diferenciação espontânea ou induzida por agentes farmacológicos como o ácido retinóico (AR). A linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y pode ser mantida em um fenótipo indiferenciado ou pode ser diferenciada para um fenótipo neuronal por tratamento com AR. O objetivo geral desse estudo foi analisar a distribuição de STC1 no hipocampo de ratos em idades diferentes e avaliar os efeitos da STC1 na viabilidade de culturas organotípicas de hipocampo submetidas à POG e em células SH-SY5Y indiferenciadas e diferenciadas com ácido all-trans-retinóico (atAR). Para isso, foram utilizadas as técnicas de imunohistoquímica, análise de marcação celular com iodeto de proídio e Hoechst, Western-blotting para Caspase 3 total e clivada e q-RT-PCR para o RNA mensageiro da stc1 e da caspase3 (casp3). A STC1 possui distribuição celular diferente em ratos de 21 dias de idade em comparação com animais de 6 e 60 dias de vida. A STC1 não protegeu as culturas organotípicas de hipocampo do dano causado pela POG e apresentou efeito neurotóxico nessas culturas. Em células SH-SY5Y diferenciadas, a STC1 apresentou efeito neurotóxico dose- dependente e a morte celular foi provocada por apoptose. Em células SH-SY5Y indiferenciadas, a STC1 também provocou clivagem de Caspase 3, porém não foi observado aumento de morte celular. A diferenciação de SH-SY5Y em neurônios leva ao aumento da expressão de stc1. O tratamento com STC1 humana recombinante não altera a expressão basal de stc1 e de casp3 em SH-SY5Y indiferenciadas ou diferenciadas. Nossos resultados, portanto, demonstram um possível papel da Stanniocalcina no desenvolvimento hipocampal em ratos jovens e um efeito neurotóxico do tratamento com STC1 em culturas organotípicas de hipocampo e em células SH-SY5Y diferenciadas em neurônios.

Stanniocalcin 1 (STC1) is an anti-hypercalcemic hormone in fish, and it is a endocrine, paracrine and autocrine hormone in mammals. Mammalian STC1 has effects in the regulation of cell calcium (Ca2+) and inorganic phosphate homeostasis, as well as effects in cell metabolism, cellular differentiation, apoptosis and cancer. STC1 is also considered to be neuroprotective, due to increased expression of STC1 in the brain of rats after ischemic stroke. Ischemia occurs from a reduction in blood flow to tissues. In the brain, ischemia causes neuronal death due to the inability of neurons to maintain ATP demands and to contain the accumulation of intracellular Ca2+. Oxygen and glucose deprivation (OGD) is an in vitro model of ischemia widely used in organotypic hippocampal slice cultures. Neuroblastoma is an extracranial solid tumor in children, and it has the propensity to spontaneously differentiate or to be induced to differentiation by pharmacological agents, such as retinoic acid (RA). The human neuroblastoma cell line SH-SY5Y can be maintained in an undifferentiated phenotype or can be differentiated into a neuronal phenotype by treatment with RA. The main objective of this study was to analyze the cellular distribution of STC1 in the hippocampus of rats with different ages and evaluate the effects of STC1 on the viability of organotypic hippocampal slice cultures subjected to OGD and undifferentiated SH-SY5Y cells and cells differentiated with all-trans- retinoic acid (atAR). Therefore, we used immunohistochemistry, analysis of cell labeling with propidium iodide and Hoechst, Western blotting for total- and clived- Caspase-3 and q-RT-PCR for STC1 and caspase3 (casp3) mRNAs. STC1 is differentially distributed in the hippocampus of 21 days old rats in comparison with 6 and 60 days old rats. STC1 did not protected organotypic hippocampal cultures against damage caused by OGD and it also had neurotoxic effects in these cultures. In differentiated SH-SY5Y cells, STC1 had neurotoxic effects in a dose-dependent manner and cell death was caused by apoptosis. In undifferentiated SH-SY5Y cells, STC1 also caused cleavage of Caspase 3, but did not increased cell death. The differentiation of SH-SY5Y cells upregulates stc1 expression. Treatment of undifferentiated and differentiated SH-SY5Y, however did not altered the basal expression of stc1 and of casp3. Our results demonstrate, therefore, a possible role of STC1 in the development of the hippocampus of young rats and a neurotoxic effect in organotypic hippocampal cultures and in SH-SY5Y cells differentiated in neurons.