Alterações neuroquímicas e neurocomportamentais causadas pela administração in vivo do ácido L-2-hidroxiglutárico em ratos neonatos e disfunção energética provocada pelo ácido D-2-hidroxiglutárico in vitro em coração de ratos adolescentes

Abstract

As acidúrias D-2-hidroxiglutárica (D-2-HGA) e L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) são distúrbios neurometabólicos caracterizados bioquimicamente pelo acúmulo tecidual e elevada excreção urinária dos ácidos D-2-hidróxiglutárico (D-2-HG) e L-2- hidroxiglutárico (L-2-HG), respectivamente. A D-2HGA tipo 1 (D-2-HGA1) é causada por mutações patogênicas no gene que codifica a enzima mitocondrial D-2- hidroxiglutarato desidrogenase (D-2-HGDH), enquanto mutações de ganho de função da enzima isocitrato desidrogenase 2 (IDH2) são a causa da D-2HGA2. As manifestações clínicas da D-2HGA1 e D-2-HGA2 são predominantemente neurológicas tais como convulsões, hipotonia e atraso no desenvolvimento psicomotor, devido a isso são consideradas acidemias orgânicas cerebrais. No entanto, a D-2HGA2 é mais severa, manifestando-se no período neonatal com alto risco de vida causada pela cardiomiopatia que acomete metade dos pacientes, ocorrendo concomitante a graves manifestações neurológicas, enquanto a D-2HGA1 corresponde a uma variante mais branda da doença com sinais exclusivamente neurológicos. Por outro lado, a acidúria L-2-hidroxiglutárica (L-2-HGA) tem como causa mutações patogênicas no gene que codifica a enzima mitocondrial FAD-dependente L-2-hidroxiglutarato desidrogenase (L-2-HGDH). Os pacientes afetados pela L-2-HGA apresentam um fenótipo clínico mais brando, homogêneo e progressivo, apresentando exclusivamente sinais neurológicos, como atraso no desenvolvimento motor e cognitivo, epilepsia, ataxia cerebelar, macrocefalia e sintomas extrapiramidais, tais como tremor e distonia, sendo também considerada uma acidúria orgânica cerebral. A neuropatologia da D-2HGA é caracterizada por atraso na maturação cerebral e anormalidades na substância branca cerebral, com alargamento dos ventrículos laterais e alterações anatômicas nos gânglios da base, enquanto a L-2HGA apresenta alterações na substância branca (leucodistrofia) e anormalidades no córtex cerebral, nos núcleos da base (núcleo denteado, globo pálido, putamen e no núcleo caudado) e no cerebelo. Tendo em vista que a patogênese do dano cerebral nos pacientes afetados por essas doenças ainda é pouco conhecida, bem como da cardiomiopatia da D- 2HGA2, a presente investigação teve por objetivo inicial avaliar os efeitos ex vivo da administração intracerebroventricular (icv) do L-2HG a ratos neonatos sobre a homeostase redox no cerebelo, bem como parâmetros imunohistoquimicos de viabilidade neuronal, reatividade astrocitária, ativação microglial e mielinização no córtex cerebral e estriado dos animais. Também foram avaliados os efeitos da administração icv de L-2- HG sobre o desenvolvimento neurocomportamental, motor e cognitivo. Em alguns experimentos, os animais foram pré-tratados intraperitonealmente com o antioxidante melatonina uma hora antes da administração icv de L-2HG. Por fim, avaliamos os efeitos in vitro do D-2-HG sobre a homeostase energética em coração de ratos adolescentes e em culturas de cardiomioblastos (H9c2). Inicialmente, avaliamos os efeitos do L-2-HG 6 horas após a administração icv sobre os parâmetros de homeostase redox no cerebelo. Os resultados mostraram que a administração de L-2-HG aumentou a oxidação da 2’,7’ - diclorofluoresceína (DCFH), refletindo uma maior produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), acompanhada de uma maior lipoperoxidação, determinada pelo aumento significativo nos níveis de malondialdeído (MDA). A injeção icv do metabólito provocou alterações do sistema antioxidante cerebelar, diminuindo as concentrações de glutationa reduzida (GSH) e aumentando as atividades das enzimas antioxidantes glutationa peroxidase (GPx) e superóxido dismutase (SOD), indicando um provável mecanismo compensatório com aumento da transcrição gênica dessas enzimas secundário a elevação das espécies reativas no cerebelo dos animais neonatos. Demonstramos também que o pré-tratamento com melatonina preveniu totalmente o aumento na produção de EROs, a lipoperoxidação e a diminuição do GSH, sem alterar as atividades das enzimas antioxidantes. Na sequência, observamos nos dias pós-natais (DPN) 15 e 75, que a administração neonatal do metabólito aumentou significativamente o conteúdo da proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e da proteína ligante de cálcio S100B, indicando aumento da reatividade astrocitária, bem como induziu a diminuição do número de células NeuN-positivas (perda neuronal), aumentou o conteúdo de Iba1 (ativação microglial) e redução das proteínas de mielina MBP e CNPase (distúrbio na mielinização) no córtex cerebral e no estriado. Além disso, a melatonina preveniu esses efeitos, sugerindo que o estresse oxidativo pode estar relacionado a esses efeitos deletérios do L-2-HG. Por fim, observou-se que uma única injeção icv de L-2-HG no período neonatal causou atraso no neurodesenvolvimento de ratos jovens e déficit cognitivo e motor nestes animais em idade adulta. Mais uma vez, a melatonina preveniu o comprometimento do desenvolvimento neuromotor e o déficit cognitivo provocado pelo L-2-HG. Em conjunto, nossos dados fornecem pela primeira vez evidências de vários mecanismos patológicos de dano cerebral causados pelo principal metabólito acumulado na L-2-HGA administrado a ratos neonatos e, mais importante, que a melatonina foi capaz de prevenir a maioria das alterações neuroquímicas, histológicas e comportamentais provocadas por este metabólito, indicando que o estresse oxidativo pode ser central na patogênese da L-2- HGA. Nesse particular, o uso de antioxidantes poderia representar uma nova estratégia terapêutica para a doença. O presente trabalho também investigou a toxicidade do D-2-HG sobre o coração, estudando seus efeitos in vitro sobre um amplo espectro de parâmetros do metabolismo energético em coração de ratos jovens e em cardiomioblastos cultivados (H9c2). O D-2- HG inibiu a respiração celular em preparações mitocondriais purificadas e homogeneizados brutos de coração de ratos jovens, bem como em células H9c2. A produção de ATP e as atividades das enzimas citocromo c oxidase (complexo IV), alfacetoglutarato desidrogenase, citrato sintase e creatina quinase também foram inibidas pelo D-2-HG, enquanto as atividades dos complexos I, II e II-III da cadeia respiratória, glutamato, succinato e malato desidrogenases não foram alterados. Também verificamos que este ácido orgânico comprometeu a capacidade de retenção de Ca²+ mitocondrial em preparações mitocondriais de coração. Finalmente, o D-2-HG reduziu a viabilidade dos cardiomioblastos H9c2 cultivados, como determinado por uma diminuição do MTT e aumento da incorporação de iodeto de propídio. Enfatize-se que o L-2-HG não alterou alguns desses parâmetros (atividades do complexo IV e da creatina quinase) em preparações mitocondriais do coração, indicando um efeito inibitório seletivo do enantiômero D. Em conclusão, presume-se que o D-2-HG compromete a bioenergética mitocondrial e a capacidade de retenção de Ca²+, o que pode contribuir potencialmente para a cardiomiopatia comumente observada na D2HGA2. Assim, drogas estimuladoras da respiração celular, tais como o bezafibrato, e a triheptanoína que é uma droga anaplerótica poderiam beneficiar os pacientes com essa doença.

D-2-hydroxyglutaric aciduria (D-2-HGA) and L-2-hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) are neurometabolic disorders biochemically characterized by tissue accumulation and high urinary excretion of D-2-hydroxyglutaric acid (D -2-HG) and L-2-hydroxyglutaric acid (L-2-HG), respectively. D-2HGA type 1 (D-2-HGA1) is caused by pathogenic mutations in the gene encoding the mitochondrial enzyme D-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (D-2-HGDH), while mutations with gain of function of the enzyme isocitrate dehydrogenase 2 (IDH2) causes D-2HGA2. The clinical manifestations of D- 2HGA1 and D-2-HGA2 are predominantly neurological, including seizures, hypotonia and delayed psychomotor development, hence they are considered cerebral organic acidurias. However, D-2HGA2 is more severe, manifesting in the neonatal period with high risk of life caused by the cardiomyopathy that affects one third of patients, occurring concomitantly with severe neurological manifestations, while D-2HGA1 corresponds to a milder variant of the disease with exclusively neurological signs. On the other hand, L- 2-hydroxyglutaric aciduria (L-2-HGA) is caused by pathogenic mutations in the gene encoding the mitochondrial FAD-dependent enzyme L-2-hydroxyglutarate dehydrogenase (L-2-HGDH). Patients affected by L-2-HGA have a milder, homogeneous and progressive clinical phenotype, presenting exclusively neurological signs, such as delayed motor and cognitive development, epilepsy, cerebellar ataxia, macrocephaly and extrapyramidal symptoms, such as tremor and dystonia, being also considered a cerebral organic aciduria. The neuropathology of D-2HGA is characterized by delayed brain maturation and abnormalities in the cerebral white matter, with enlargement of the lateral ventricles and anatomical changes in the basal ganglia, while L-2HGA has white matter changes (leukodystrophy) and abnormalities in the cerebral cortex, the basal ganglia (dentate nucleus, globus pallidus, putamen, and caudate nucleus), and the cerebellum. Considering that the pathogenesis of brain damage in patients affected by these diseases is still poorly understood, as well as of D-2HGA2 cardiomyopathy, the present investigation initially aimed to evaluate the ex vivo effects of intracerebroventricular (icv) administration of L-2HG to neonatal rats on redox homeostasis in the cerebellum, as well as immunohistochemical parameters of neuronal viability, astrocyte reactivity, microglial activation, and myelination in the cerebral cortex and striatum of the animals. The effects of icv administration of L-2-HG on neurobehavioral, motor and cognitive development were also evaluated. In some experiments, animals were intraperitoneally pretreated with the antioxidant melatonin one hour before icv administration of L-2HG. Finally, we evaluated the in vitro effects of D-2-HG on energy homeostasis in adolescent rat hearts and in cardiomyoblast (H9c2) cultures. Initially, we evaluated the effects of L-2-HG 6 hours after icv administration on redox homeostasis parameters in the cerebellum. The results showed that L-2-HG administration increased the oxidation of 2',7' - dichlorofluorescein (DCFH), reflecting an increased production of reactive oxygen species (ROS), accompanied by an increased lipoperoxidation, determined by a significant increase in malondialdehyde (MDA) levels. The icv injection of the metabolite also altered the brain antioxidant system, decreasing the concentrations of reduced glutathione (GSH) and increasing the activities of the antioxidant enzymes glutathione peroxidase (GPx) and superoxide dismutase (SOD), indicating a likely compensatory mechanism with increased gene transcription of these enzymes secondary to the elevation of reactive species in the cerebellum of neonatal animals. We also demonstrated that pretreatment with melatonin totally prevented the increase in ROS production, lipid peroxidation and decrease in GSH, without altering the activities of the antioxidant enzymes. Subsequently, we observed at postnatal days (PND) 15 and 75, that neonatal administration of the metabolite significantly increased the content of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and calcium-binding protein S100B, indicating increased astrocyte reactivity, as well as induced a decrease in the number of NeuN-positive cells (neuronal loss), increased Iba1 content (microglial activation) and reduced myelin proteins MBP and CNPase (disturbance in myelination) in the cerebral cortex and striatum. Furthermore, melatonin prevented these effects, suggesting that oxidative stress may be involved in these deleterious effects. Finally, it was observed that a single icv injection of L-2-HG in the neonatal period caused delayed neurodevelopment in young rats and cognitive and motor deficits in these animals at adulthood. Once again, melatonin prevented the impairment of neuromotor development and cognitive deficit caused by L- 2-HG. Taken together, our data provide for the first time evidence for several pathological mechanisms of brain damage caused by the major metabolite accumulated in L-2-HGA administered to neonatal rats and, more importantly, that melatonin was able to prevent most of the neurochemical, histological and behavioral changes caused by this metabolite, indicating that oxidative stress may be central to the pathogenesis of L-2-HGA. We propose that antioxidants may serve in the future as adjunctive therapy for patients with L-2-HGA. The present work also investigated the toxicity of D-2-HG on the heart, studying its in vitro effects on a wide spectrum of energy metabolism parameters in young rat hearts and in cultured cardiomyocytes (H9c2). D-2-HG inhibited cellular respiration in purified mitochondrial preparations and crude homogenates from young rat hearts, as well as in H9c2 cells. ATP production and the activities of cytochrome c oxidase (complex IV) of the respiratory chain, as well as of alpha-ketoglutarate dehydrogenase, citrate synthase and creatine kinase were also inhibited by D-2-HG, while the activities of complexes I, II and II- II, glutamate, succinate and malate dehydrogenases were not altered. We also verified that this organic acid compromised the mitochondrial Ca²+ retention capacity in mitochondrial preparations from the heart and in H9c2 myoblasts. Finally, D-2-HG reduced the viability of cultured H9c2 cells, as determined by a decrease in MTT and by an increase in propidium iodide incorporation. It should be emphasized that L-2-HG did not change some of these parameters (complex IV and creatine kinase activities) in heart mitochondrial preparations, indicating a selective inhibitory effect of the D-enantiomer. In conclusion, it is assumed that D-2-HG compromises mitochondrial bioenergetics and Ca²+ retention capacity, which could potentially contribute to the cardiomyopathy commonly seen in D2HGA2. Thus, drugs that stimulate cellular respiration, such as bezafibrate, and triheptanoin, which is an anaplerotic drug, could benefit patients with this disease.