Trans-translation inhibition in ESKAPE bacteria and its perspectives as an antibiotic adjuvant

Abstract

Hoje em dia estamos ameaçados sob o risco de voltar à era préantibiótica devido à disseminação da resistência antimicrobiana. O ressurgimento da morte por infecções, que eram consideradas facilmente tratáveis, exige a descoberta de novos antibióticos e, mais importante, de novas classes de antibióticos com mecanismos diferentes dos atuais. Nesse contexto, podemos citar o processo de trans-tradução. A trans-tradução é o principal sistema de resgate ribossomal bacteriano que libera o ribossomo parado no final de 3' do RNA e há algum tempo o processo de trans-tradução tem sido considerado como um grande alvo antibiótico, possuindo várias características que o tornam uma boa promessa: i) só está presente em células procarióticas, ii) é onipresente em todos os gêneros de bactérias, iii) não visado pelos antibióticos atuais e iv) é essencial para o fitness bacteriano, pois foi demonstrado que, mesmo que sua ausência não mate as bactérias, cria vários fenótipos diferentes, o que inclui perda de tolerância ao antibiótico ou perda de virulência. Nosso objetivo foi rastrear uma grande biblioteca química em busca de moléculas que visem a trans-tradução e combinálas com antibióticos utilizados na prática médica. Examinamos a Biblioteca Química Francesa (CN - coleção essencial de 1080 compostos) para encontrar moléculas capazes de inibir a trans-tradução. Os experimentos foram realizados conforme previamente publicado por Macé et al e Guyomar et al onde a transtradução foi avaliada in vitro e in vivo (modelo celular). O modelo celular foi realizado utilizando um mutante de Escherichia coli contendo um plasmídeo constituído por genes repórteres que indicavam quando a trans-tradução era inibida. O modelo molecular envolvia a produção de um marcador fluorescente quando a trans-tradução estava ativa, portanto, se a molécula estivesse inibindo a trans-tradução, não haveria fluorescência. Para isso, utilizamos o kit de síntese de proteínas in vitro PURExpressâ da NEB. Após a triagem inicial, foi identificado um potencial hit ("molécula 404") inibindo aproximadamente 50% da transtradução in vitro. A partir desse acerto, 28 derivados foram sintetizados e testados: 6 outros compostos inibiram pelo menos 20% da trans-tradução. A molécula 404 apresentou forte atividade de inibição in vivo com dois de seus derivados mais ativos, PD5 e PD24. Combinações e ensaios de inibição foram realizados contra patógenos ESKAPE com uma variedade de antibióticos. Dentre as 90 combinações testadas, 16 apresentaram redução positiva na concentração inibitória mínima (CIM) do antibiótico em relação ao seu uso isolado. Considerando que todas as bactérias utilizadas estão na lista prioritária da OMS para serem alvo do desenvolvimento de antibióticos e que os antibióticos utilizados estavam na Lista de Medicamentos Essenciais da OMS, a possibilidade de reduzir os perfis de resistência inibindo a trans-tradução merece atenção especial. Este trabalho é a primeira prova de conceito mostrando que os inibidores da trans-tradução podem atuar como adjuvantes de antibióticos para o tratamento de bactérias clinicamente importantes e podem servir como um guia para as possibilidades desse alvo.

Nowadays we are threatened under the risk of going back to the preantibiotic era due to the spreading of antimicrobial resistance. The resurgence of death to infections, which were considered easily treatable calls for the discovery of new antibiotics and most importantly new antibiotic classes with mechanism that are different from the current ones. In this context we can cite the transtranslation process. The trans-translation is the main ribosomal rescue system that frees ribosome stalled at 3’ end of nonstop RNA and for some time now the transtranslation process has been considered as a great antibiotic target, possessing several traits that makes it a good promise: i) it is only present in procaryotic cells, ii) it is ubiquitous to all bacteria genera, iii) not targeted by current antibiotics and iv) it is essential to the bacterial fitness as it was demonstrated that even if its absence does not kill the bacteria, it creates several different phenotypes which includes loss of tolerance to antibiotic or loss of virulence. Our objective was to screen a large chemical library in search of molecules that target trans-translation and combine them with antibiotics used in medical practice. We screened the French Chemical Library (CN - essential collection 1080 compounds) to find molecules capable of inhibiting trans-translation. The experiments were performed as previously published by Macé et al and Guyomar et al where trans-translation was evaluated in vitro and in vivo (cell model). The cell model was performed using a mutant of Escherichia coli containing a plasmid consisting of reporter genes that indicated when the trans-translation was inhibited. The molecular model involved in producing a fluorescent marker when trans-translation was active so if the molecule was inhibiting trans-translation there would not be fluorescence. To do this we utilized the PURExpressâ in vitro protein Synthesis kit by NEB. After the initial screening, a potential hit was identified (“molecule 404”) inhibiting approximately 50% of trans-translation in vitro. From this hit, 28 derivatives were synthesized and tested: 6 other compounds inhibited at least 20% of transtranslation. Molecule 404 showed strong trans-translation inhibition activity in vivo with two of its most active derivatives, PD5 and PD24. Combinations and inhibition assays have been performed against ESKAPE pathogens with a range of antibiotics. Among 90 combinations tested, 16 showed a positive reduction in the minimum inhibitory concentration (MIC) of the antibiotic compared to its use alone. Considering that all the bacteria used are on the WHO priority list to be targeted by antibiotic development and that the antibiotics used were on the WHO Essential Medicines List, the possibility of reducing resistance profiles by inhibiting trans-translation deserves special attention. This work is the first proof of concept showing that trans-translation inhibitors can act as antibiotic adjuvants to treat clinically important bacteria and may serve as a guide to the possibilities of this target.