Avaliação da imunotoxicidade de agrotóxicos em linhagens monocíticas

Abstract

Agrotóxicos são usados para o controle e prevenção de pragas durante o cultivo e após a colheita, melhorando a produtividade e a qualidade da produção agrícola. Estes compostos podem apresentar propriedades imunotóxicas e risco potencial para a saúde humana devido à exposição por meio de alimentos, água potável, meio ambiente e local de trabalho. Os distúrbios do sistema imunológico destacam-se por estarem intimamente ligados a múltiplos órgãos, incluindo os sistemas nervoso, endócrino, reprodutivo, cardiovascular e respiratório, levando a mudanças transitórias ou permanentes. Considerando a relevância dos agrotóxicos em nosso meio e o objetivo de aumentar a produtividade das culturas, se faz necessário elucidar os efeitos ainda não descritos ou bem compreendidos sobre a imunidade inata e adaptativa (celular e humoral), uma vez que estes agrotóxicos estão disponíveis no mercado são largamente utilizados. Também, ao considerar que os testes de imunotoxicidade não estão dentro dos novos endpoints exigidos para liberação de agrotóxicos publicado na nova RDC nº 294 da ANVISA, se faz necessário investigar efeitos até então não observados e, talvez, úteis em uma potencial reavaliação. Portanto, o presente estudo objetivou avaliar a potencial imunotóxico dos agrotóxicos clomazona, glifosato, imidacloprido e sulfentrazona em duas linhagens celulares (RAW 264.7 e THP-1). Foram revisados estudos durante os últimos dez anos sobre os mecanismos envolvidos na imunotoxicidade de fungicidas, herbicidas e inseticidas em células, animais e humanos (manuscrito I). Os mecanismos envolvidos na imunotoxicidade destas três classes analisadas estão relacionados a alterações em células imunes inatas e adaptativas, na resposta imune celular e humoral, bem como na alteração do sistema imunológico por vários mecanismos, como fatores pró-inflamatórios e anti-inflamatórios. O segundo manuscrito apresenta resultados da avaliação in vitro do efeito imunotóxico do imidacloprido utilizando macrófagos murinos RAW 264.7 após tempos de incubação curtos (24h) e longos (96h). Os resultados mostraram evidências do potencial efeito imunomodulador na resposta inflamatória associados à exposição crônica ao imidacloprido, indicando as mitocôndrias como reguladoras da resposta 14 imune inata por meio de diferentes mecanismos. O manuscrito 3 investigou a toxicidade dos três herbicidas comerciais (clomazona, glifosato e sulfentrazona) usando células THP-1 após 24 h de incubação para elucidar o papel de alguns mecanismos de toxicidade. O estresse oxidativo se mostrou como uma importante via de toxicidade do herbicida sulfentrazona. Além disso, foi observado que o herbicida clomazona apresentou uma despolarização mitocondrial, enquanto a sulfentrazona causou hiperpolarização após 24 h de incubação, trazendo novamente as mitocôndrias como um importante alvo de citotoxicidade mediada por herbicidas. Ademais, nossos resultados demonstraram que os níveis da citocina pró-inflamatória IL-8 foram significativamente aumentados em células THP-1 incubadas com glifosato após 24 h de exposição, evidenciando o efeito do glifosato como poderoso agente de imunotoxicidade celular. O quarto manuscrito por sua vez, traz dados da imunotoxicidade celular dos herbicidas clomazona, glifosato e sulfentrazona após 96 h de incubação utilizando como modelo in vitro células de macrófagos murinos RAW 264.7. Foi observado um aumento de radicais livres após incubação com os herbicidas clomazona e sulfentrazona em células RAW 264.7. Nossos resultados sugerem que os agrotóxicos imidacloprido, clomazona, glifosato e sulfentrazona induzem alterações no sistema imunológico por vários mecanismos, como fatores pró-inflamatórios e anti-inflamatórios e adicionalmente, evidenciamos que a mitocôndria é um dos alvos intracelulares do inseticida, bem como dos herbicidas aqui testados.

Pesticides are used to control and prevent pests during cultivation and after harvest, improving productivity and the quality of agricultural production. These compounds may have immunotoxic properties and a potential risk to human health due to exposure to food, drinking water, the environment, and the workplace. Immune system disorders are closely linked to multiple organs, including the nervous, endocrine, reproductive, cardiovascular, and respiratory systems, leading to transient or permanent changes. Considering the relevance of pesticides in our environment and the objective of increasing crop productivity is necessary to elucidate the effects yet to be described or well understood since these pesticides available on the market are being used, it is necessary to elucidate the effects not yet described or well understood on innate and adaptive immunity (cellular and humoral) since these pesticides available on the market are being used. They also considered that immunotoxicity tests are not within the new endpoints required for pesticide release published in ANVISA's new RDC No. Therefore, the present study aimed to evaluate the immunotoxic potential of the pesticides clomazone, glyphosate, imidacloprid, and sulfentrazone in two cell lines (RAW 264.7 and THP-1). Studies were reviewed during the last ten years on the mechanisms involved in the immunotoxicity of fungicides, herbicides, and insecticides in cells, animals, and humans (manuscript I). The mechanisms involved in the immunotoxicity of these three analyzed classes are related to changes in innate and adaptive immune cells, in the cellular and humoral immune response, and the alteration of the immune system by various mechanisms, such as pro-inflammatory and anti-inflammatory factors. The second manuscript presents the in vitro evaluation of the immunotoxic effect of imidacloprid using RAW 264.7 murine macrophages after short (24h) and long (96h) incubation times. The results showed evidence of the potential immunomodulatory effect on the inflammatory response associated with chronic exposure to imidacloprid, indicating mitochondria as regulators of the innate immune response through different 16 mechanisms. Manuscript 3 investigated the toxicity of three commercial herbicides (clomazone, glyphosate, and sulfentrazone) using THP-1 cells after 24 h of incubation to elucidate the role of some toxicity mechanisms. Oxidative stress proved to be an essential pathway of toxicity of the herbicide sulfentrazone. Furthermore, it was observed that the herbicide clomazone showed mitochondrial depolarization, while sulfentrazone caused hyperpolarization after 24 h of incubation, bringing mitochondria back as an essential target of herbicide-mediated cytotoxicity. Furthermore, our results demonstrated that the levels of the pro-inflammatory cytokine IL-8 were significantly increased in THP-1 cells incubated with glyphosate after 24 h of exposure, evidencing the effect of glyphosate as a powerful agent of cellular immunotoxicity. The fourth manuscript, in turn, presents data on the cellular immunotoxicity of the herbicides clomazone, glyphosate, and sulfentrazone after 96 h of incubation using RAW 264.7 murine macrophage cells as an in vitro model. An increase in free radicals was observed after incubation with the herbicides clomazone and sulfentrazone in RAW 264.7 cells. Incubation with the herbicides was again related to immunotoxic effects, demonstrated by the inadequate response of RAW 264.7 cells after inflammatory stimulation. Again, these compounds were observed to affect mitochondrial function, depolarizing the mitochondria after incubation with the tested pesticides. Changes in TNF levels were also verified after exposure to the herbicides clomazone, glyphosate, and sulfentrazone in RAW 264.7 cells. Our results suggest that the pesticides imidacloprid, clomazone, glyphosate, and sulfentrazone induce alterations in the immune system by several mechanisms, such as pro-inflammatory and anti-inflammatory factors and, additionally, we show that mitochondria are one of the intracellular targets of the insecticide, as well as of the herbicides here tested.