Caracterização molecular em pacientes com Hemofilia B no Rio Grande Do Sul

Abstract

A hemofilia B (HB) (OMIM 306900) consiste em uma doença da coagulação de herança recessiva ligada ao X e afeta 1 a cada 30.000 nascimentos no sexo masculino. Essa doença genética é causada por mutações no gene do fator IX (F9) da coagulação. Existem cerca de 1095 mutações diferentes descritas em HB, com a prevalência de mutações do tipo missense(sentido trocado). Essas variantes levam a sangramentos, especialmente após injúrias vasculares ou cirurgias. A gravidade dos sangramentos está relacionada com a magnitude da deficiência do fator. A forma como as mutações interferem na função do FIX não é claramente determinada; diferentes aspectos poderiam estar envolvidos, como modificaçõesestruturais, perda de estabilidade e mudanças eletrostáticas. Este estudo tem o objetivo de (a) identificar mutações no gene F9 em pacientes com hemofilia B leve, moderada e grave, vivendo no sul do Brasil, estado do Rio Grande do Sul; (b) analisar a função das mutações na determinação da doença e fazer correlações entre o genótipo e o fenótipo, buscando regiões, domínios e aminoácidos que são determinantes para a função do FIX; e (c) investigar efeitos estruturais e eletrostáticos no FIX, de mutações previamente detectadas como causa da hemofilia B. Um total de 43 pacientes independentes diagnosticados com HB foi incluído no estudo. A atividade de coagulação do fator IX foi medidaatravés de ensaios de coagulação, e os pacientes foram classificados conforme os testes laboratoriais em leves (n=6), moderados (n=7) e graves (n=30). O DNA genômico foi extraído e todos os éxons do F9, regiões 5 ́UTR e 3 ́UTR, junções éxon-íntron e região promotora foram amplificados por PCR. Foi realizado o seqüenciamento direto para a detecção de mutações eas seqüências dos pacientes foram comparadas com a sequência do gene F9 normal utilizando a ferramenta CodonCodeAligner, implementado no software MEGA 5. As variações encontradas foram comparadas com aquelas presentes no Haemophilia B MutationDatabase (http://www.factorix.org/) e quando não estavam presentes nesse, nas ferramentas 1000 Genomes Browser e USCS Genome Browser, para verificar se eram polimorfismos. As mutações missense foram analisadas utilizando o BLASTP e UNIPROTKB/Swiss-ProtMammaliandatabase, comparando resíduos do FIX humano com seqüências do FIX ortólogas depositadas no mesmo banco de dados. Cinco algoritmos foram empregados para verificar o impacto das mutações missense encontradas na estrutura da proteína: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping-2), SiFT (Sorting Intolerant to Tolerant), HOPE (Have yOur Protein Explained), PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), and Mutation Taster. Um total de 54 diferentes mutações missense foi usado em análises de estrutura, 18 delas oriundas do nosso estudo em pacientes do sul do Brasil e as outras 36descritas no Banco de Dados do Fator IX. Foram gerados modelos estruturais para cada mutação através de modelagem por homologia por meio do Phyre-2. Os modelos foram utilizados em análises de potencial eletrostático e em clusterizações por diferença eletrostática, com o objetivo de fazer uma comparação dos modelos mutantes com a estrutura e características físico-químicas do Fator IX normal. Os cálculos de potencial eletrostático (PE) foram realizados no sofware Delphi webserver e aplicados nos modelos por meio da interface Chimera. Para a clusterização das estruturas foi utilizada a ferramenta webPIPSA. Foram encontradas 31 variantes distintas entre as 43 famílias HB, incluindo 6 mutações que não estavam descritas no Banco de Dados do Fator IX. Nenhuma das variantes foi encontrada nos bancos de dados1000 Genomes Browser e UCSC Genome Browser. Entre as variantes encontradas existe a predominância de mutações de sentido trocado(23/31), seguida de sem sentido (4/31), processamento (2/31) e pequenas deleções (2/31). A maioria das mutações detectadas foi considerada como deletéria pelas predições dos algoritmos. Os tipos de mutações encontradas no Rio Grande do Sul apresentam uma distribuição que não se distancia daquelas observadas em pesquisas prévias. Considerando os modelos usados nas análises de clusterização, a análise de diferenças eletrostáticas mostrou que 31 dos 54 modelos analisadossão diferentes da estrutura selvagem. A distância eletrostática dessas 31 mutações em relação à estrutura normal varia conforme a mutação e poderia interferir com as funções do fator IX, causando HB.

Hemophilia B (HB) (OMIM 306900) consists of an inherited X-linked recessive bleeding disorder and affects 1 in 30,000 male live births. This genetic disease is caused by mutations in the coagulation factor IX gene (F9).There are about 1,095 different HB mutations described, with a prevalence of missense mutations. These variations lead to a bleeding tendency, especially after injuries or surgery. The severity of bleeding symptoms is connected with the magnitude of the clotting factor deficiency. The role of how mutations interfere on FIX function is not clearly determined; different aspects could be involved, as structural modifications, loss of stability and electrostatic changes. This study has the objectives of (a) identify F9 mutations in patients with mild, moderate and severe hemophilia B living in the southern Brazilian state of Rio Grande do Sul; (b) analyze the role of the mutations in disorder determination and make phenotype- genotype correlations, looking for the regions, domains and amino acids that are determinants of FIX function; (c) investigate FIX structural and electrostatic effects of previously detected and now hemophilia B causative missense mutations. A total of 43 independent patients affected by HB were included in this study. Coagulation activity (FIX: C) was measured using the one-stage clotting assay, and then the patients were classified according to the laboratory tests into mild (n= 6), moderate (n= 7) and severe (n= 30) hemophilies. Genomic DNA was extracted and all F9 exons, the 5 ́UTR and 3 ́UTR, intron-exon junctions and the promoter region were amplified by PCR. Direct sequencing was conducted for mutation detection. Patients ́ sequences were compared with the normal F9 gene sequence (GeneBank accession number K02402) using the Codon Code Aligner tool implemented with the MEGA 5 software. The variations detected were compared with those reported in the Haemophilia B Mutation Database (http://www.factorix.org/) and when not found there, in the 1000 Genomes browser and USCS Genome browser to verify if they were polymorphisms. The missense mutations were examined using BLASTP and the UNIPROTKB/Swiss-Prot Mammalian database, comparing the human FIX residues (Swiss Prot ID: P00740) with orthologous FIX sequences deposited in the same databank. Five algorithms wereemployed to analyze the impact of the missense mutations found on protein structure: PolyPhen-2 (Polymorphism Phenotyping-2), SiFT (Sorting Intolerant to Tolerant, HOPE (Have yOur Protein Explained), PROVEAN (Protein Variation Effect Analyzer), and Mutation Taster. A total of 54 different HB missense mutations were employed in the structural analysis, 18 of them detected in our study of southern Brazilian patients and the other 36 described in the factor ix database. A structural model for each missense mutation was generated by homology approaches using Phyre2. The models were employed in electrostatic potential analyses and clusterization by electrostatic differences using bioinformatics tools, aiming to compare the mutant models with the structure and physicochemical characteristics of normal Factor IX. The electrostatic potential (EP) calculations were performed using the Delphi webserver and applied on the models using Chimera Interface. For the models ́clusterization the webPIPSA tool was employed. Thirty-one non-redundant variations were found among the 43 HB families, including 6 mutations not previously described in the Factor IX mutation database. None of the variations were found on the 1000 Genomes Browser or UCSC Genome Browser. Between the variations detected, there is a predominance of missense (23/31), followed by nonsense (4/31), splicing site (2/31) and small deletion (2/31) mutations. The majority of the detected mutations were considered deleterious by algorithm predictions. The different mutation types detected in Rio Grande do Sul presented a distribution not much different from those observed in previous surveys. Considering the models used in theclusterization analysis, the electrostatic differences evaluation revealed that 31 of the 54 mutations were considered as divergent, compared to the wild structure. The electrostatic distances of these 31 mutations compared to normal vary according to the mutation and could have interfered in Factor IX functions, causing HB.