Estudo in vitro da atividade antitumoral do ditelureto de difenila e mecanismos de ação relacionados em células tumorais

Abstract

O câncer colorretal (CCR) é uma doença de grande impacto econômico e social, principalmente em países emergentes, ocupando a posição de terceiro lugar entre as neoplasias malignas mais frequentes no mundo, além de apresentar elevada taxa de mortalidade. Nesse cenário, os compostos organotelurados (OT) se apresentam como agentes com potencial futuro emprego na terapia antitumoral. O ditelureto de difenila (DTDF), um composto OT, induziu citotoxicidade, genotoxicidade, clastogenicidade e parada do ciclo celular em células de mamífero (V79) reportado em estudos. Esses efeitos, em parte, são devido a inibição da enzima topoisomerase I (TOP1) e indução de estresse oxidativo, os quais sugeriram a possibilidade de investigar a ação citotóxica dessa molécula em células de câncer. Neste sentido, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do DTDF em HCT116 (CCR) em comparação a células não tumorais MRC5 (fibroblasto humano), determinando possíveis mecanismos de ação que estão envolvidos no processo citotóxico. Os resultados indicaram que as células HCT116 são mais sensíveis aos efeitos citotóxicos do DTDF quando comparadas à linhagem MRC5. Nesta direção, também ocorreu a diminuição da viabilidade celular em células HeLa expostas ao DTDF. No contexto de morte celular, foi observada a indução de apoptose nas linhagens HCT116 e HeLa expostas ao DTDF por 24 e 48 h, sendo que o processo apoptótico ocorreu de maneira dependente de caspases. Além disso, nas linhagens HCT116 e MRC5 tratadas com o DTDF ocorreu a parada no ciclo celular, expressa pelo acúmulo de células em fase G2/M em 24 e 48 h de exposição. Esses efeitos observados podem ser consequência de danos no DNA, e a avaliação pelo ensaio cometa mostrou o aumento de danos de DNA em HCT116 e MRC5 expostas ao DTDF em relação ao controle em ambas as condições de 3 e 24 h. De modo interessante, foi constatado que o aumento de quebras duplas de DNA foi induzido em HCT116 e HeLa expostas ao DTDF por 1 h, efeito que foi verificado pelo aumento da fosforilação da histona H2AX, ocorrendo principalmente em células que se encontram em fase S do ciclo celular. Uma causa possível da formação de quebras duplas é a inibição de TOP1 e/ou indução de estresse oxidativo. Tendo isso em vista, foi observado que a exposição de HCT116 e MRC5 ao DTDF levou a estabilização de complexos clicáveis de topoisomerase I (ccTOP1), indicando efeito de inibição da enzima TOP1 do tipo poison. A exposição das células HCT116 e MRC5 ao DTDF por 3 e 24 h induziu o aumento de estresse oxidativo, verificado pelo aumento de espécies reativas de oxigênio (EROs). Os resultados apresentados nesse estudo apontam os mecanismos de ação que induzem a formação de quebras duplas de DNA induzidos pelo DTDF em células replicativas, efeito que pode ser explicado pela estabilização de ccTOP1 e indução de EROs. Como consequência destes efeitos, a diminuição de viabilidade celular e indução de processo apoptótico por via de caspases induzidos pelo DTDF afirmam o efeito antiproliferativo em células de CCR e o potencial dessa molécula de ser aplicada na terapia antitumoral.

Colorectal cancer (CRC) presents high economic and social impact, especially in emerging countries, occupying the third position among the most frequent malignant neoplasms in the world, in addition presenting a high mortality index. Organotellurium compounds (OT) stand out in this emerging scenario in the search for new anticancer compounds presenting high cytotoxicity in cancer cells. Diphenyl ditelluride (DPDT), an OT compound, presents antigenotoxic and antimutagenic activity at non cytotoxic doses, while in cytotoxic doses the antiproliferative activity was evidenced in mammalian cells (V79). In cytotoxic doses the DPDT showed effects of genotoxicity, clastogenicity and cycle arrest induction. Furthermore, inhibition of topoisomerase I (TOP1) enzyme was evidenced for the first time in Saccharomyces cerevisiae and by plasmid DNA relaxation assay. The aim of the study was to evaluate the cytotoxicity of this DPDT in CRC (HCT116) and human fibroblast (MRC5) cell lines, determining the mechanisms of action occurring in cellular level. Results showed that CRC HCT116 cells are more sensitive to DPDT-induced cytotoxicity when compared to the human fibroblast MRC5. Evaluated by the comet assay, the DNA damage increased in HCT116 treated with DPDT presented higher DNA damage index when compared to MRC5 in both 3 and 24 h of exposure. The DNA double strand breaks induction was evidenced by histone H2AX phosphorylation induction in HCT116 and cervical cancer cell (HeLa) exposed to DTDF at 1 h, an event that occurred mainly in replicative (S phase) cells. The exposure of HCT116 and MRC5 to DPDT induced the stabilization of TOP1- DNA cleavable complexes (TOP1cc), indicating a poison effect induced by DPDT in TOP1 enzyme. The HCT116 and MRC treated with DPDT at 3 and 24 h increase oxidative stress, evidenced by the increasing of reactive oxygen species (ROS). In addition, exposure of cells to DTDF led to cell cycle arrest, expressed by accumulation in G2/M phase in HCT116 and MRC5 at 24 and 48 h of exposure. The evaluation of apoptosis induction, when cells are exposed to DPDT, occurs the accumulation of cells in late apoptosis after 24 and 48 h of DPDT exposure. The same methodology to detect apoptosis was performed pre-incubating condition with caspase inhibitor, which inhibit the induction of apoptosis e increasing the cell viability, showing that DPDT-induced apoptosis occurs in a caspase dependent manner. The results presented in this study points the mechanisms of action that leads the double strand breaks formation, effect that leads to TOP1cc stabilization and ROS induction. Consequently, these effects of cell viability decreased and apoptosis induction in DPDT-induced cytotoxicity process, affirm the antiproliferative effect on CCR cells and the potential of this molecule to be appliedin antitumor therapy.