Avaliação da confiabilidade de um modelo de dor orofacial inflamatória crônica induzido pela administração intra-articular de adjuvante completo de Freund (CFA) em Ratos Wistar

Abstract

Introdução: O modelo de artrite em ratos induzido pela administração de Adjuvante Completo de Freund (CFA) é bem caracterizado na literatura e é rotineiramente empregado para busca de novos fármacos para o tratamento da dor inflamatória, incluindo a osteoartrite. A administração de CFA na articulação temporomandibular (ATM) tem sido utilizada como um modelo de dor orofacial inflamatória crônica. A lesão do tecido periférico decorrente da indução do modelo geralmente produz aumento da sensibilidade térmica, bem como da sensibilidade mecânica. Objetivo: Dessa forma, considerando a importância do uso de modelos confiáveis para investigação de novas opções de tratamento em estudos pré-clínicos, este estudo teve como objetivo avaliar o curso temporal do desenvolvimento da dor orofacial inflamatória crônica em ratos, induzida por injeção unilateral de CFA na ATM, procurando determinar parâmetros objetivos que justifiquem seu uso. Como objetivo secundário foram investigados os efeitos da administração de melatonina sobre a hiperalgesia induzida pela morfina em ratos. Materiais e Métodos: No experimento 1, 22 ratos Wistar adultos foram divididos em dois grupos: sham (solução salina) e dor (injeção intra-articular de 50 μl de CFA na ATM direita). A sensibilidade mecânica da região da ATM foi verificada usando um analgesímetro eletrônico von Frey no baseline e nos dias 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23 e 25 após a indução do modelo. Além disso, os testes de acetona e Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) foram realizados para avaliar a sensibilidade térmica. Os comportamentos locomotor e exploratório, e do tipoansioso foram avaliados pelos testes do Campo Aberto e Labirinto em Cruz Elevado, respectivamente. Os níveis de IL-1β, IL-10 e BDNF foram mensurados pela técnica de ELISA no gânglio trigeminal. A avaliação qualitativa do grau de inflamação na área retrodiscal foi feita por meio de histologia e microscopia óptica. A pontuação foi baseada em um sistema pelo qual a porcentagem de células mononucleares infiltrantes foi classificada como ausente, leve, moderada e grave. No experimento 2, 70 ratos Wistar machos adultos foram divididos em oito grupos: Sham+Veículo+Salina (SVS); Sham+Veículo+Morfina (SVMo); Sham+Melatonina+Salina (SMeS); Sham+Melatonina+Morfina (SMeMo); Dor+Veículo+Salina (DVS); Dor+Veículo+Morfina (DVMo); Dor+Melatonina+Salina (DMeS); Dor+Melatonina+Morfina (DMeMo). Os animais foram tratados por oito dias consecutivos com morfina (5 mg/Kg s.c.) e/ou melatonina (50 mg/Kg i.p.), ou seus respectivos veículos. A hiperalgesia mecânica da região da ATM foi verificada pelo von Frey eletrônico no baseline e nos dias 13, 14, 18, 21 e 22 após a indução do modelo. Além disso, foram realizados os testes de acetona, OPAD Campo Aberto e Labirinto em Cruz Elevado. Os dados foram avaliados utilizando teste “t” e “U” de Mann-Whitney para dados não paramétricos e expressos como média ± erro padrão da média (EPM) ou mediana e intervalo interquartil, considerando significativos P < 0,05. O SPSS 20.0 para macOS foi usado para análise estatística. Este projeto foi avaliado e aprovado pela CEUA-HCPA (#20200689). Resultados: Experimento 1: foi observado o estabelecimento do modelo de dor nos seguintes parâmetros: 1. diminuição da latência de retirada da face no teste de von Frey entre os dias sete e 23 após a injeção de CFA; 2. diminuição do número de lambidas no teste OPAD; 3. redução do índice de ansiedade no Labirinto em Cruz Elevado; 4. aumento do número de rearings no Open Field; 5. redução dos níveis de BDNF no gânglio trigeminal; 6. aumento do espessamento do disco articular e maior escore de inflamação na ATM. Experimento 2: houve replicação do modelo de dor do experimento 1, indexado pela redução do limiar nociceptivo no teste de von Frey. Observou-se efeito do modelo, da morfina e da melatonina no teste do Labirinto em Cruz Elevado, enquanto que nos parâmetros do teste do Campo Aberto e teste da acetona, não houve efeito. Apesar do reduzido número de animais, foi possível observar o efeito antinociceptivo da morfina que foi incrementado pela administração conjunta da melatonina. Nos períodos e doses avaliadas não foi possível determinar a hiperalgesia e tolerância induzidas pela morfina. Por outro lado, os resultados demonstram que a melatonina não apresentou efeito analgésico agudo na dose utilizada, necessitando de administração repetida para induzir analgesia neste modelo de dor. Além disso, a melatonina induziu uma potencialização em relação a analgesia da morfina, demonstrando um excelente efeito sinérgico. Estes efeitos da melatonina se mantêm por pelo menos 24h após o final do tratamento. Outra observação importante é que a ação dos fármacos é estado específico, uma vez que os resultados distintos em animais com e sem dor. Conclusão: Esta dissertação demonstra que a administração intra-articular de CFA na ATM em ratos pode ser utilizada para avaliar alterações agudas e crônicas que mimetizam a artrite inflamatória da ATM. No entanto, os estudos crônicos são limitados a 25 dias após a injeção de CFA, pois a partir desse período a dor não está mais presente. No segundo experimento, os resultados preliminares permitem concluir que a melatonina é capaz de potencializar a analgesia induzida pela morfina, que permanece por pelo menos 24 horas após o final do tratamento, assim como a analgesia induzida pela melatonina per se, que necessita de doses repetidas para induzir efeito analgésico. Mais estudos estão em andamento para melhor entender os efeitos observados.

Introduction: The arthritis model in rats induced by the administration of Complete Freund's Adjuvant (CFA) is well characterized in the literature, being routinely used to screen for new drugs for the treatment of inflammatory pain, including osteoarthritis. The administration of CFA into the temporomandibular joint (TMJ) has been used as a model of chronic inflammatory orofacial pain. Peripheral tissue injury resulting from the model usually produces increased thermal as well as mechanical sensitivity. Aim: Thus, considering the importance of using reliable models to investigate new treatment options in preclinical studies, this study aimed to evaluate the temporal course of the development of chronic inflammatory orofacial pain in rats, induced by unilateral injection of CFA into the TMJ, seeking to determine objective parameters that justify its use. As a secondary objective, the effects of melatonin administration on morphine-induced hyperalgesia in rats were investigated. Materials and methods: In experiment 1, 22 adult male Wistar rats were divided into two groups: sham (saline solution) and pain (intra-articular injection of 50 μl of CFA into the right TMJ). Mechanical sensitivity of the TMJ region was verified using an electronic von Frey analgesimeter at baseline and on days 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, and 25 after model induction. In addition, the Acetone and the Operant Orofacial Pain Assessment Device (OPAD) tests were performed to assess thermal sensitivity. The locomotor and exploratory, and anxiety-like behaviors were evaluated by the Open Field and Elevated Plus Maze tests, respectively. The levels of IL-1β, IL-10 and BDNF were measured by ELISA in the trigeminal ganglion. Qualitative assessment of the degree of inflammation in the retrodiscal area was performed using histology and light microscopy. Scoring was based on a system whereby the percentage of infiltrating mononuclear cells was classified as absent, mild, moderate, and severe. In experiment 2, 70 adult male Wistar rats were divided into eight groups: Sham+Vehicle+Saline (SVS); Sham+Vehicle+Morphine (SVMo); Sham+Melatonin+Saline (SMeS); Sham+Melatonin+Morphine (SMeMo); Pain+Vehicle+Saline (DVS); Pain+Vehicle+Morphine (DVMo); Pain+Melatonin+Saline (DMeS); Pain+Melatonin+Morphine (DMeMo). The animals were treated during eight consecutive days with morphine (5 mg/kg s.c.) and/or melatonin (50 mg/kg i.p.), or their respective vehicles. The mechanical sensitivity of the TMJ region was verified using an electronic von Frey analgesimeter at baseline and on days 13, 14, 18, 21 and 22 after model induction. In addition, the acetone and the OPAD tests were performed to assess thermal sensitivity. The locomotor and exploratory, and anxiety-like behaviors were evaluated by the Open Field and Elevated Plus Maze tests, respectively. Ethical approval was obtained from CEUA-HCPA (#20200689). Results: Experiment 1: the establishment of the pain model was observed in the following parameters: 1. decrease in face withdrawal latency in the von Frey test between days seven and 23 after CFA injection; 2. decrease in the number of licks in the OPAD test; 3. reduction of the anxiety index in the Elevated Plus Maze; 4. increase in the number of rearings in the Open Field; 5. reduction of BDNF levels in the trigeminal ganglion; 6. increased joint disc thickening and higher TMJ inflammation score. Experiment 2: the pain model from experiment 1 was replicated, indexed by the reduction of the nociceptive threshold in the von Frey test. There was an effect of the model, morphine and melatonin in the Elevated Plus Maze test, while no effects were observed in the parameters of the Open Field and the Acetone tests. Despite the small number of animals, it was possible to observe the antinociceptive effect of morphine that was increased by the combined administration of melatonin. The hyperalgesia and tolerance induced by morphine could not be observed at the current time and dose. On the other hand, the results demonstrate that melatonin did not present an acute analgesic effect at the dose employed, requiring repeated administration to induce analgesia in this model. In addition, melatonin induced a potentiation of the morphine analgesia, demonstrating an excellent synergistic effect. These effects of melatonin are maintained for at least 24 hours after the end of treatment. Another important observation is the state-specific effect, since drug-induced effects have temporally different effects between the sham and pain groups. In conclusion, this dissertation demonstrates that intra-articular administration of CFA into the TMJ in rats can be used to assess acute and chronic changes that mimic TMJ inflammatory arthritis. However, chronic studies are limited to 25 days after CFA injection, since after this period, pain is no longer present. In the second experiment, the preliminary results enable us to conclude that melatonin is capable of potentiating the morphine-induced analgesia, which persists for at least 24 hours after the end of treatment, as well as melatonin-induced analgesia per se, which requires repeated doses to induce an analgesic effect. More studies are underway aiming to better understand the observed effects.