Desenvolvimento de proposta de monografia farmacopeica de inflorescências de Cannabis sativa L.

Abstract

A espécie vegetal Cannabis sativa L. tem acompanhado o desenvolvimento da humanidade desde os seus primórdios, sendo utilizada para diversas finalidades e em diversos contextos socioculturais, destacando-se as aplicações terapêuticas e medicinais. Ao longo do século XX, no entanto, diversos controles e restrições sobre as atividades envolvendo a espécie foram estabelecidos internacionalmente. Apesar disso, o uso medicinal da Cannabis e de seus derivados tem ganhado interesse nas últimas décadas, especialmente por pacientes com doenças debilitantes e refratários às alternativas terapêuticas existentes. Como consequência, diversos modelos regulatórios têm sido desenvolvidos ao redor do mundo a fim de possibilitar o acesso à espécie para fins medicinais. No Brasil, o marco regulatório referente a esse tema tem evoluído notavelmente desde 2015, embora vários aspectos ainda estejam pendentes de regulamentação. Diante disso, nota-se a necessidade de definição de especificações de qualidade relevantes de modo a reduzir os riscos associados ao uso dos produtos da Cannabis e possibilitar a caracterização adequada de medicamentos a serem avaliados em estudos clínicos. Nesse contexto, a aplicação de ferramentas de Qualidade Analítica por Design (AQbD, sigla em inglês), incluindo os desenhos experimentais (DoE, sigla em inglês), pode permitir contornar os desafios analíticos envolvidos na obtenção de métodos adequados a tais finalidades. Diante do exposto, o presente estudo teve como objetivo desenvolver métodos analíticos e especificações aplicados ao controle da qualidade de inflorescências de C. sativa, a fim de possibilitar a elaboração de uma monografia a ser incluída na Farmacopeia Brasileira. Também foi elaborada uma revisão dos principais marcos regulatórios referentes ao uso medicinal da espécie ao redor do mundo, com o intuito de contribuir para a evolução futura do marco regulatório nacional, com ênfase na definição de critérios técnicos e de qualidade harmonizados com os já aplicados em outros países. Em relação às especificações de qualidade, foram propostos critérios referentes à identificação botânica macroscópica e microscópica do material de interesse, com a elaboração de ilustrações pertinentes, a serem incluídas na proposta de monografia. Além disso, um método por cromatografia em camada delgada (TLC, sigla em inglês) também foi proposto para a identificação e monitoramento do perfil cromatográfico do material vegetal. Para tanto, um estudo para otimização da fase móvel foi conduzido com aplicação de um desenho experimental de mistura. As condições otimizadas possibilitaram a obtenção de cromatogramas que refletem o perfil de canabinoides majoritários das amostras, além de permitir a discriminação entre os principais quimiotipos da espécie. O método foi validado em relação à sua seletividade, precisão e robustez. Por fim, um método por cromatografia em fase líquida de alta eficiência com detecção por arranjo de diodos (HPLC-DAD, sigla em ingês) foi proposto para quantificação simultânea de cinco canabinoides majoritários (ácido canabidiólico, canabidiol, ácido tetraidrocanabinólico, Δ9- tetraidrocanabinol e canabinol) em inflorescências de C. sativa. O processo de desenvolvimento analítico envolveu a aplicação de uma abordagem orientada por AQbD. As variáveis experimentais críticas relativas ao preparo da amostra e às condições cromatográficas foram otimizadas utilizando a Metodologia de Superfície de Resposta (RSM, sigla em inglês). A aplicação das condições experimentais otimizadas possibilitou a resolução de 12 canabinoides no nível da linha de base em uma análise de 35 min. O método foi validado segundo as diretrizes da legislação nacional vigente de forma a demonstrar sua seletividade, linearidade, precisão, exatidão e robustez. O potencial do método como indicativo de estabilidade também foi avaliado por meio de estudo de degradação forçada, com resultados satisfatórios. Assim, com a combinação dos métodos por HPLCDAD e TLC, é possível obter informações suficientes para a caracterização adequada do perfil de constituintes da amostra. A aplicação de desenhos experimentais durante o desenvolvimento dos métodos supracitados também permitiu um melhor entendimento do comportamento cromatográfico dos analitos em função das variáveis experimentais, o que pode facilitar o processo de adaptações futuras desses métodos para atender às necessidades específicas de laboratórios distintos. Como produto deste estudo, foi elaborada uma proposta de monografia referente às inflorescências de C. sativa, apresentada em anexo, a ser submetida à avaliação da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) para inclusão na Farmacopeia Brasileira.

The plant species Cannabis sativa L. has accompanied humankind since ancient times, being used for different purposes and in different sociocultural contexts, among which one can highlight its therapeutic and medicinal applications. Nonetheless, throughout the 20th century, a series of controls and restrictions on activities involving the species began to be adopted internationally. Despite that, medical uses of Cannabis and its derivatives have gained interest in recent decades, especially among patients with debilitating diseases for which the existing therapeutic alternatives are limited. As a consequence, a diversity of regulatory models which allow access to medical Cannabis have been developed around the world. In Brazil, an evolution of the regulatory framework has been noticeable since 2015, although several aspects are still to be addressed. Accordingly, the need for defining relevant quality specifications so as to reduce the risks associated with the use of those products and favor the appropriate characterization of the medicines to be evaluated in clinical studies is worthy of being highlighted. It should be noted, however, that the complexity of plant matrices and the structural similarity between cannabinoids make analytical development a challenging task. In this scenario, the application of Analytical Quality by Design (AQbD) tools, including Design of Experiments (DoE), can favor the development of fit-for-purpose analytical methods. In view of the above, this study aims to develop analytical methods and specifications for quality control of C. sativa inflorescences in order to enable the elaboration of a monograph to be included in the Brazilian Pharmacopoeia. An overview of the main regulatory frameworks for medical Cannabis around the world is also presented with the aim of contributing to the future evolution of the national regulatory framework, with an emphasis on the definition of technical and quality criteria harmonized with those already applied in other countries. Regarding the quality specifications, acceptance criteria for macroscopic and microscopic botanical identification of the material of interest, along with pertinent illustrations, were proposed to be included in the monograph draft. Furthermore, a Thin Layer Chromatography (TLC) method was proposed for the identification and monitoring of the chromatographic profile of the herbal material. A Mixture experimental design was applied for optimization of the mobile phase. The optimized conditions allowed obtaining chromatograms that reflect the samples' cannabinoids profile, in addition to enabling the discrimination between the main chemotypes of the species. The method was validated regarding its selectivity, precision, and ruggedness. Finally, a High-Performance Liquid Chromatography with Diode Array Detector (HPLC-DAD) method for simultaneous quantification of five major cannabinoids (cannabidiolic acid, cannabidiol, tetrahydrocannabinolic acid, Δ9- tetrahydrocannabinol and cannabinol) in C. sativa samples was developed by applying an AQbD-driven approach. The critical experimental variables regarding sample preparation and chromatographic conditions were optimized using Response Surface Methodology (RSM). Baseline resolution of 12 cannabinoids was achieved in a 35 min-chromatographic analysis applying the optimized experimental conditions. The method was fully validated according to the current national guidelines in order to demonstrate its selectivity, linearity, precision, accuracy, and ruggedness. The stability-indicating properties of the method were also verified by performing a forced degradation study. Wherefore, the combination of the HPLC-DAD and TLC methods would provide enough information for the appropriate characterization of the sample’s constituents’ profile. It should also be noted that the application of experimental designs during the development of the aforementioned methods allowed for a better understanding of the chromatographic behavior of the analytes as a function of the experimental variables, which favors further adaptations to meet the specific needs of individual laboratories. As a product of this study, a monograph draft for C. sativa inflorescences was prepared (presented in the annex) to be submitted for evaluation by the Brazilian Health Regulatory Agency (ANVISA) for inclusion in the Brazilian Pharmacopoeia.