Desenvolvimento de nanoemulsões catiônicas peguiladas visando à terapia gênica para a mucopolissacaridose tipo I

Abstract

A mucopolissacaridose tipo I (MPS I) é uma doença herdada de forma autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima ά-L-iduronidase (IDUA), levando ao acúmulo intracelular de heparan e de dermatan sulfato em diversos tecidos. Este estudo teve por objetivo avaliar as potencialidades de nanoemulsões catiônicas peguiladas como um sistema de transferência gênica para o plasmídeo pIDUA em um modelo murino de MPS I. Formulações constituídas de um núcleo oleoso de triglicerídeos de cadeia média estabilizado pelo lipídeo catiônico DOTAP e pelos fosfolipídeos DOPE e DPSPE-PEG foram preparadas pelo procedimento de homogeneização à alta pressão. O pIDUA foi associado as nanoemulsões por adsorção ou encapsulamento de complexos pré-formados pIDUA-DOTAP na fase interna das nanoemulsões. A complexação do pIDUA com as nanoestruturas e a sua proteção frente à degradação pela enzima DNAse I foi demonstrada através de estudos de retenção em gel de agarose para ambos os modos de complexação. A presença do fosfolipídeo DSPE-PEG nas formulações teve um papel crucial na manutenção do diâmetro dos nanocomplexos na presença de proteínas do soro. Uma maior estabilidade do complexo obtido por encapsulamento foi detectada, uma vez que não foi verificada a liberação do pIDUA a partir destes complexos mesmo após 48 horas de incubação em soro. Uma organização lamelar foi identificada para as nanoemulsões por difração de raios X de energia dispersiva. A associação do pIDUA as formulações por adsorção ou encapsulamento conduz a estruturas menos organizadas. Complexos obtidos na relação de cargas +4/- foram administrados intravenosamente em camundongos nocaute MPS I. Foi demonstrado um aumento da atividade de IDUA (ensaio de fluorescência) e da expressão (RT-qPCR) em diferentes órgãos, em especial no fígado e nos pulmões, em comparação aos camundongos não tratados. A dose e o tempo parecem influenciar a transfecção nos diferentes órgãos avaliados. Não foram detectadas evidências de efeito deletério nos cortes histológicos dos tecidos dos principais órgãos após administração intravenosa dos complexos. O conjunto de resultados demonstra o potencial das nanoemulsões catiônicas contendo DSPE-PEG como um sistema de transferência gênica para MPS I.

Mucopolysaccharidosis type I (MPS I) is an autosomal disease caused by ά-L-iduronidase (IDUA) deficiency, leading to intracellular accumulation of dermatan and heparan sulfate in different tissues. This study aimed at evaluating the application of PEGylated cationic nanoemulsions complexed with pIDUA as a gene transfer system in a MPS I murine model. Formulations composed of an oil core of medium chain triglycerides stabilized by the cationic lipid DOTAP, and the phospholipids DOPE and DSPE-PEG were prepared by high pressure homogenization procedure. pIDUA was associated to nanoemulsions by adsorption or encapsulation of preformed pIDUA-DOTAP complexes into the inner phase of nanoemulsions. The complexation of pIDUA with nanostructures and its protection against DNAse I degradation was demonstrated by the retention of complexes in agarose gel assay for both complexation procedures. The presence of the phospholipid DSPE-PEG plays a crucial role to maintain the narrow size of nanocomplexes in the presence of serum proteins. A higher stability of the complex obtained by encapsulation was detected once it was not detected the release of pIDUA from complexes even after 48 hours of incubation in serum. A lamellar organization was identified for nanoemulsions by energy dispersion X ray. The pIDUA association by adsorption or by encapsulation led to a less organized structures. Complexes obtained at +4/- charge ratio were administered intravenously in MPS I knockout mice. An increase in IDUA activity (fluorescence assay) and expression (RT-qPCR) was detected in different organs, especially in lungs and liver, in comparison with non-treated mice. Dose and time seem to influence the transfection in the evaluated organs. No evidence of deleterious effect was detected in histological analysis of main organ tissues after intravenous administration of such complexes. The overall results show the potential of the cationic nanoemulsions containing DSPE-PEG as a gene transfer system to MPS I.