Avaliação in vitro do potencial terapêutico do extrato da fasciola hepatica em fibroblastos sinoviais de pacientes com artrite reumatoide

Abstract

Introdução: A atrite reumatoide (AR) é uma doença crônica autoimune que afeta principalmente as articulações. Os fibroblastos sinoviais (FLS) são as principais células estromais da sinóvia articular, e apresentam estão envolvidos na degradação da cartilagem e na erosão óssea. Não há cura médica ou cirúrgica conhecida para a AR e as opções terapêuticas atuais não são efetivas na manutenção e indução da remissão da doença. Por essa razão, moléculas com ação anti-inflamatória e imunomoduladora estão sendo estudadas a partir de extratos de helmintos. A Fasciola hepatica (F. hepatica) é um helminto que libera produtos excretores-secretores através de seu tegumento que contêm componentes imunomoduladores capazes de suprimir a resposta imune Th1 e a produção de citocinas inflamatórias. Objetivo: Avaliar in vitro o potencial terapêutico do extrato de F. hepatica em FLS de pacientes com AR. Materiais e métodos: Primeiramente, os FLS foram isolados do líquido sinovial de pacientes com AR, cultivados, e caracterizados para os marcadores fenotípicos CD55, CD90 e CD68. Após, os FLS foram expostos a diferentes concentrações do extrato de F. hepatica (60 μg/ml, 80 μg/ml e 100 μg/ml) e analisados após 24 h, 48 h e 72 h pelo ensaio de proliferação celular (MTT). O efeito do extrato também foi avaliado através do índice de morfometria nuclear (NMI), ensaio de apoptose, aderência celular, invasão e migração e produção de TNF-α. As análises estatísticas foram realizadas por ANOVA ou teste T e p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados: O extrato de F. hepatica reduziu a proliferação celular dos FLS na concentração de 100 μg/ml após 48 h (83,8 % ± 5,0 extrato vs 100,0 % ± 00 controle; p < 0,05), e nas concentrações de 80 μg/mL (88,4 % ± 3,0 extrato vs 100,0 % ± 0,0 controle; p < 0,05) e 100 μg/ml (89,8 % ± 3,8 extrato vs 100,0 % ± 0,0 controle; p < 0,05) após 72 h, quando comparado ao grupo controle sem tratamento. Baseado nesses resultados, a dose de 100 μg/ml no tempo de 48 h foi escolhida para os testes seguintes. O tratamento com o extrato de F. hepatica não afetou parâmetros de NMI nem induziu apoptose ou morte celular nos FLS. Por outro lado, o extrato demonstrou redução da capacidade de aderência dos FLS (92,0 células ± 5,8 extrato vs 116,3 células ± 7,9 controle; p < 0,05), do potencial migratório (69,5 % ± 17,6 extrato vs 100,0 % controle; p < 0,05) e da invasão celular (80,3 % ± 3,9 extrato vs 100,0 % controle; p < 0,05). Além disso, houve uma tendência na redução dos níveis de TNF-α após o tratamento com o extrato. Conclusão: Em conjunto, nossos resultados apontam o extrato de F. hepatica como uma potencial estratégia terapêutica para AR, devido à sua capacidade de reduzir o perfil agressivo e invasivo dos FLS, sem induzir apoptose ou morte celular. Análises adicionais in vitro e estudos in vivo em modelos experimentais de artrite são necessárias para uma melhor compreensão dos mecanismos do efeito do extrato da F. hepatica e de seus diferentes componentes nos FLS.

Introduction: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic autoimmune disease that mainly affects the joints. Fibroblast-like synoviocytes (FLS) are the main stromal cells of the joint synovium, and are involved in cartilage degradation and bone erosion. There is no known medical or surgical cure for RA and current therapeutic options are not effective in maintenance and induction of disease remission. For this reason, molecules with anti-inflammatory and immunomodulatory action are being studied from helminth extracts. Fasciola hepatica (F. hepatica) is a helminth that releases excretory-secretory products through its tegument which contains immunomodulatory components capable of suppressing the Th1 immune response and the production of inflammatory cytokines. Objective: To evaluate the therapeutic potential of F. hepatica extract in FLS from patients with RA. Materials and methods: First, the FLS were isolated from synovial fluid of RA patients, cultured and characterized for the phenotypic markers CD55, CD90 and CD68. After, the FLS were exposed to different concentrations of F. hepatica extract (60 μg/ml, 80 μg/ml and 100 μg/ml) and analyzed after 24 h, 48 h and 72 h by the cell viability assay (MTT). The effect of the extract was also evaluated by nuclear morphometry index (NMI), apoptosis assay, cell adherence, invasion and migration tests, and TNF-α production. Statistical analyzes were performed by ANOVA or T test and p < 0.05 was considered statistically significant. Results: F. hepatica extract decreased the cell viability of FLS at concentration of 100 μg/ml after 48 h (83.8 % ± 5.0 extract vs 100.0 % ± 0.0 control; p < 0.05), and at concentrations of 80 μg/ml (88.4 % ± 3.0 extract vs 100.0 % ± 0.0 control; p < 0.05) and 100 μg/ml (89.8 % extract ± 3.8 extract vs 100.0% ± 0.0 control; p < 0.05) after 72 h, when compared with control group without treatment. Based on these results, the dose of 100 μg/ml after 48 h was chosen for the following tests. The treatment with F. hepatica extract does not affect NMI parameters or induce apoptosis or cell death on FLS. On the other hand, the extract showed a decreased of FLS adherence (92.0 cells ± 5.8 extract vs 116.3 cells ± 7.9 control; p < 0.05), migratory potential (69.5 % ± 17.6 extract vs 100.0 % control; p < 0.05) and cell invasion (80.3 % ± 3.9 extract vs 100.0 % control; p < 0.05). Moreover, there was a trend of decreased TNF levels after extract treatment. Conclusions: Taken together, our results point out F. hepatica extract as a potential strategy for AR due to their ability to reduce the aggressive and invasive profile of FLS without inducing apoptosis and cell death. However, further analyses in vitro and in vivo are needed for a better understanding the mechanisms of the effect of F. hepatica extract on FLS and its different components on FLS.