Desenvolvimento de metodologia analítica para caracterização de extratos de Erythrina verna Vell.

Abstract

A utilização de matérias-primas para a produção de medicamentos exige criteriosa inspeção para que seja classificada como apta ao processo industrial. Nesse sentido, se faz necessário o estabelecimento de técnicas e critérios a serem inseridos em compêndios oficiais, como no Brasil, a Farmacopeia Brasileira (FB). Com o lançamento da Política de Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos, no ano de 2006, o mercado nacional de produtos naturais recebeu um forte impulso para o desenvolvimento do setor fitoterápico. Dentre as plantas com possível exploração pela indústria de fitoterápicos, destacamos a leguminosa Erytrina verna Vell., popularmente conhecida como mulungu, que é uma espécie arbórea, nativa do sudeste do Brasil, medindo cerca de 15 metros e apresentando flores vermelho-vivo em cacho. Inúmeros estudos creditam aos alcaloides contidos na espécie as suas propriedades ansiolíticas, anticonvulsivante, analgésica, entre outras. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi definir os parâmetros para o controle de qualidade das cascas de Erythrina verna, droga vegetal inscrita na primeira edição da FB. Assim, foram determinados os parâmetros de identificação por Cromatografia em Camada Delgada e os parâmetos físico-químicos farmacopeicos como material estranho, cinzas totais e perda por dessecação. Desenvolveu-se um método por Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (CLAE) acoplada a detector de arranjo de diodos (CLAEDAD) para a quantificação dos alcaloides de E. verna, com a adição de bromidrato de galantamina como padrão interno. O método cromatográfico proposto foi validado conforme parâmetros preconizados pela RDC 166/17, e demonstrou ser linear, sensível, específico, preciso, exato e robusto para análise quantitativa dos extratos alcaloídicos das cascas de Erythrina verna Vell.. A fim de maximizar o rendimento do teor total de alcaloides das cascas de Erythrina verna, empregou-se a técnica de delineamento experimental de Box-Behnken Design (BBD). Para isto, o modelo verificou a influência da relação planta: solvente (X1), tempo de extração (X2) e granulometria (X3) no rendimento do extrato alcaloídico das cascas de E. verna. Os resultados demonstraram a influência dos fatores estudados, sendo que a condição ótima para a extração de alcaloides de E. verna encontra-se na razão droga:solvente 1:60 (m/v), tempo de 5,47 horas com faixa granulométrica de 710-1000 µm, proporcionando um rendimento estimado pelo modelo matemático de 0,625 g%. Do extrato alcaloídico obtido, foram isolados 5 compostos por CLAE, que foram analisados através de Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massas (CG-EM) e Espectrometria de Massas de Alta Resolução – Ionização de Eletrospray (EMAR-IES). Assim, foi possível identificar um alcaloide pertencente à subclasse dienoide, 11-hidroxi-eritravina, e quatro alcaloides alcenoides: 11-hidroxi-eritratidinona, 3-demetoxi-eritratidinona, eritratidinona e dihidroerisotrina. Ainda, a metodologia de CLAE desenvolvida neste trabalho permitiu distinguir as quatro espécies de cascas de Erythrina (E. verna, E. velutina, E. poeppigiana e E. falcata) utilizadas sob a mesma denominação comum e diferentes partes de E. verna (cascas, flores e folhas). Tendo em vista os efeitos dos alcaloides eritrínicos sobre o sistema nervoso central, a fração de alcaloides totais otimizada de E. verna foi avaliada quanto a seus efeitos inibitórios frente a enzima Monoamina Oxidase (MAO), utilizando modelo de zebrafish. E. verna apresentou uma concentração inibitória de 50% (CI50) de 0,8538 ± 0,1806 mg/mL. Considerando que não existem dados farmacopeicos disponíveis sobre cascas de E. verna, esses resultados podem ser úteis para o controle de qualidade e para produzir derivados padronizados.

The use of raw materials for the industrial production requires careful inspection to be in accordance of quality control parameters. In this sense, it is important to establish techniques and criteria to be inserted in official compendia, as in Brazil, the Brazilian Pharmacopoeia. The National Policy on Medicinal Plants and Phytotherapy was published in 2006 and the national market of natural products received a strong incentive for the development of phytotherapics. Among plants with industrial interest, we highlight the leguminous Erytrina verna Vell., popularly known as mulungu. E. verna is a tree, measuring about 15 meters, native from southeastern Brazil and showing bright red flowers in a bunch. Several studies correlate the alkaloids of this specie with their anxiolytic, anticonvulsive, analgesic and others properties. In this context, this study aimed to determinate parameters for quality control of Erythrina verna trunk barks, plant drug enrolled in the first edition of BF. Thus, it was performed the identification parameters by Thin Layer Chromatography and the pharmacopoeial physicochemical parameters, such as foreign matter, total ashes and loss on drying. A method by highperformance liquid chromatography coupled with a diode array detector (HPLC-DAD) was developed for quantification of E. verna alkaloids using galantamine hydrobromide as internal standard. The proposed chromatographic method was validated according to the RDC 166/17 and was linear, sensitive, specific, precise, accurate and robust for the quantitative analysis of the E. verna trunk barks alkaloid extracts. In order to maximize the yield of total alkaloid content of E. verna trunk barks, the Box-Behnken Design (BBD) experimental design was employedSo, the model verified the influence of the plant: solvent ratio (X1), extraction time (X2) and granulometry (X3) on the alkaloid extract yield of E. verna trunk barks. The results showed the influence of these factors and the optimal condition for alkaloids extraction of E. verna was on the drug: solvent ratio 1:60 (w/v), time of 5.47 hours with granulometric range of 710-1000 μm. The estimated yield of the mathematical model was 0.625 g%. It was isolated by HPLC 5 compounds from the alkaloids extract which were analyzed by GC-MS and HRMS-ESI. Thus, it was possible to identify one alkaloid of dienoid subclass, 11-hydroxyerythravin, and four alkenoid alkaloids: 11-hydroxyerythratidinone, 3-demethoxyerythratidinone, erythratidinone and dihydroerysotrine. Also, the CLAE methodology developed in this work allowed to distinguish four Erythrina bark species (E. verna, E. velutina, E. poeppigiana and E. falcata) used under the same common denomination and different parts of E. verna, (barks, flowers and leaves). Taking in account the effects of erythrin alkaloids on central nervous system, the optimum total alkaloid fraction of E. verna was evaluated for its inhibitory effects against the Monoamine Oxidase (MAO) enzyme using a zebrafish model. E. verna showed an inhibitory concentration of 50% (IC50) of 0.8538 ± 0.1806 mg/mL. Considering that there are no pharmacopoeial data available for E. verna trunk barks, these results may be useful for quality control and to produce standardized derivatives.