Estudo abrangente sobre aspectos clínicos e diagnósticos da deficiência de GLC-NAC-Fosfotransferase (Mucolipidoses II e III)

Abstract

Introdução: As Mucolipidoses (ML) II e III são doenças lisossômicas raras, causadas pela atividade deficiente da GlcNAc-1-fosfotransferase, codificada pelos genes GNPTAB e GNPTG, causando alteração na atividade das hidrolases lisossomais (aumentadas em plasma, reduzidas em fibroblastos e normal em leucócitos). O padrão-ouro para o diagnóstico de ML II/III é a demonstração da deficiência intracelular da atividade da GlcNAc1-fosfotransferase e/ou identificação de mutações patogênicas em GNPTAB ou GNPTG, que estão disponíveis em poucos centros. Deste modo, a confirmação diagnóstica geralmente é baseada na medida da atividade hidrolases lisossomais, tanto em plasma como em fibroblastos. Entretanto não há consenso sobre quais enzimas devem ser pesquisadas e diferentes painéis são randomicamente utilizados, com fracas evidências para embasar esta prática. Há poucos estudos sobre a história natural das ML II/III, não existindo estudos brasileiros sobre o tema. Objetivos Gerais: 1) Identificar manifestações clínicas e caracterizar a funcionalidade em uma amostra de pacientes brasileiros com ML II e III. 2) Caracterizar a atividade das enzimas lisossomais em pacientes brasileiros com diagnóstico confirmado de ML II/III, visando propor um protocolo diagnóstico custo-efetivo. Objetivos Específicos: 1) Estudar as diferenças clÍnicas entre os subtipos de mucolipidose III (gama e alfa/beta); 2) Caracterizar a funcionalidade dos pacientes com ML II e III no Brasil; 3) Classificar os fototipos dos pacientes com ML e compará-los com seus pais e com controles (indivíduos saudáveis), a fim de ser detectada possível tendência de hipomelanogênese; 4) Estudar a associação entre cor de pele, olhos e cabelos e os seguintes SNPs: rs1126809 (TYR gene), rs16891982 (SLC45A2 gene), rs1426654 (SLC24A5 gene) and rs1129038 (HERC2 gene). Metodologia: Estudo transversal, amostragem por conveniência, incluindo pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico ou genético de ML II/III. Os dados clínicos foram obtidos de forma retrospectiva, por entrevista com familiares e revisão de prontuário. Pacientes com MLII/III, >1 ano e seus pais, assim como controles saudáveis e pais destes,avaliados sobre características de pele, cabelo e olhos usando a escala de Fitzpatrick e classificação visual. SNPs [rs1126809 (TYR gene), rs16891982 (SLC45A2 gene), rs1426654 (SLC24A5 gene) e rs1129038 (HERC2 gene)] foram genotipados por KASP (LGC Genomics: www.lgcgenomics.com). Para o protocolo bioquímico, desenvolvemos uma pontuação baseada em 11 itens para escolher quais enzimas deveriam ser inclusas no painel do protocolo (quanto maior a pontuação, mais adequada). Resultados: 1) Para caracterização clínica, inclusos 27 pacientes (ML II=15, ML III alfa/beta= 9, ML IIIl gama=3). Sintomas relacionados ao sistema esquelético foram predominantes em ambos grupos. Pacientes ML II demonstraram maior gravidade do envolvimento cognitivo e somático. Pacientes ML III alfa/beta apresentaram atraso nos marcos iniciais do desenvolvimento e possuíam comprometimento somático maior que ML III gama. Os nossos dados também sugerem que pacientes ML II apresentam hiperparatireoidismo transitório no início da infância, sem evidência de necessidade de tratamento. 2) Para caracterização bioquímica, incluídos 26 pacientes (ML II=14, ML III alfa/beta=9, ML III gama=3). Destes, todos possuíam atividade enzimática avaliada no plasma e 15 em fibroblastos. Em plasma, todas as enzimas exibiram média da atividade elevada, com exceção da quitotriosidase; em fibroblastos apenas a média da atividade da beta-glicosidase foi normal, enquanto todas as outras foram reduzidas. As pontuações mais altas foram atingidas por alfa-manosidase (29 pontos), alfa–L-iduronidase (28 pontos), betahexosaminidase total (27 pontos), beta-glicuronidase (26 pontos), e alfa–Nacetilglicosaminidase (25 pontos). 3) No estudo de pigmentação, 17 pacientes (MLII=7, MLIII alfa/beta=7, ML III gama=3) e 29 pais foram incluídos, assim como 20 controles saudáveis e 34 pais de controles. A maioria dos pacientes apresentou fototipo (Fitzpatrick) I–III (n=14/17, 82%) taxa discrepante do fototipo de seus pais (n=19/29, 66%), dos controles saudáveis (n=14/20, 70%) e pais de controles (n=25/34, 74%). Quanto à associação genótipo-fenótipo, as diferenças entre fenótipo e cor esperada como suposto pelo fenótipo foram: para rs1126809, 2/17 pacientes tiveram cabelos mais claros; para rs16891982, 4/17, 6/17 e 10/17 pacientes apresentavam, respectivamente, olhos, cabelos e da pele e 3/17, 4/17 and 2/17 pacientes, respectivamente, olhos, cabelo e pele mais escuros; e para rs1426654, 2/17, 1/17, 1/17 pacientes tiveram olhos, cabelos e pele mais clara e 9/17 e 3/17 h tinham cabelo e pele mais escuro; para rs1129038, 6/16 pacientes apresentavam olhos mais escuros que o esperado. 3) Em relação à testagem genética, os nossos dados sugerem que a análise de GNPTAB e GNPTG pode ser feita por seqüenciamento de nova geração, e que a a identificação das mutações patogênicas que segregam na famíia é de suma importância para a identificação de heterozigotos e diagnóstico pré-natal. Conclusão: Esta é a primeira série de casos de pacientes ML II/III no Brasil, onde a MLII parece ser o tipo mais comum. Além disso, as ML II/III tem diagnóstico tardio, sintomas multissistêmicos e aparentam exibir modificações na melanogênese (mais comum hipomelanose), porém estudos adicionais são necessários para confirmar estes achados. Levando em consideração as enzimas avaliadas neste estudo, sugerimos aferir a atividade enzimática em ao menos três enzimas que obtiveram pontuação mais alta na nossa análise. Este painel enzimático propõe ser um método mais rápido, simples e com menor custo para o diagnóstico bioquímico. O seqüenciamento de nova geração parece ser uma boa alternativa para a confirmação diagnóstica desses pacientes.

Introduction: Mucolipidosis (ML) II and III are rare lysosomal diseases caused by GlcNAc-1- phosphotransferase deficiency, which is encoded by the GNPTAB and GNPTG genes, leading to altered activity of lysosomal hydrolases (increased in plasma, reduced in fibroblasts, and normal in leukocytes). Gold-standard method for diagnosis of ML II / III is the demonstration of intracellular deficiency of GlcNAc-1-phosphotransferase activity and/or identification of pathogenic mutations in GNPTAB or GNPTG, which are available in few centers. Thus, the diagnostic confirmation of ML II / III is usually based on measurement of many lysosomal hydrolases activities, both in fibroblasts and in plasma. However, there is no consensus about which enzymes should be investigated, and different random panels are used, with weak evidence to support this practice. Few studies about the natural history of ML II/III are available, besides that, there are no Brazilian studies about this theme. General Objectives: 1) Identify clinical manifestations and characterize functionality in a sample of Brazilian patients with ML II and III; and 2) To characterize the activity of lysosomal enzymes in Brazilian patients with confirmed diagnosis of ML II / III, aiming to propose a cost-effective diagnostic protocol. Specific Objectives. 1) Study clinical differences between mucolipidosis subtype III (alpha/beta and gamma; 2) To characterize functionality of ML II and III patients in Brazil; 3) To classify phototypes of ML II / III patients and compare them to their parents and to controls (healthy individuals), to identify possible trends to hypomelanogenesis; and 4) To study the association between skin, eyes, and hair color and the following SNPs: rs1126809 (TYR gene), rs16891982 (SLC45A2 gene), rs1426654 (SLC24A5 gene), and rs1129038 (HERC2 gene). Methods: Cross-sectional study, with convenience sample, including patients with a clinical and biochemical, or genetic, diagnosis of ML II/III. Clinical and demographic data were obtained retrospectively by chart review and / or interview with the family. Brazilian patients with ML II/III, >1yo, and parents, as well as healthy controls and their parents, were evaluated on characteristics of skin, hair, and eyes using the Fitzpatrick scale and visual classification. SNPs [rs1126809 (TYR gene), rs16891982 (SLC45A2 gene), rs1426654 (SLC24A5 gene), and rs1129038 (HERC2 gene)] were genotyped with KASP genotyping assay (LGC Genomics: www.lgcgenomics.com). For biochemical protocol, we developed a score based on 11 items to choose from which enzymes should be included in the protocol panel (the higher the score, the better suited). Results: 1) For clinical characterization we included 27 patients (ML II= 15, ML III alpha/beta= 9, ML III gamma=3), Skeletal systemrelated symptoms were predominant in both groups. ML II patients demonstrated greater physical and cognitive severity, ML III alpha / beta had delay in initial developmental milestones and somatic impairments were greater than ML III gamma. Our data also suggest that the ML II patients presented transient hyperparathyroidism in early infancy without apparent need of treatment; 2) For biochemical characterization, a total of 26 patients were included (ML II=14, ML III alpha/beta=9, ML III gamma=3). Of these, all 26 had lysosomal enzyme activity evaluated in plasma and 15 in fibroblasts. In plasma, all enzymes exhibited high mean activity, except for chitotriosidase; in fibroblasts, only mean beta-glucosidase activity was normal, while all others were reduced. The highest scores were assigned to αmannosidase (29 points), α–L-iduronidase (28 points), total β-hexosaminidase (27 points), βglucuronidase (26 points), and α–N-acetylglucosaminidase (25 points). 3) In the pigmentation study, 17 patients (ML II=7, ML III alpha/beta=7, ML III gamma=3) and 29 parents were included in the study, as well as 20 healthy controls and 34 control parents. Most patients had Fitzpatrick skin types I–III (n=14/17, 82%), discrepant rate of their parents' skin type (n=19/29, 66%), of healthy controls (n=14/20, 70%), and control parents (n=25/34, 74%). Regarding genotype-phenotype association, for rs1126809, 2/17 had lighter hair than expected; for rs16891982, 4/17, 6/17, and 10/17 patients had, respectively, lighter eyes, hair, and skin color, and 3/17, 4/17, and 2/17 patients had, respectively, darker eyes, hair, and skin color than expected; and for rs1426654, 2/17, 1/17, and 1/17 had lighter eyes, hair, and skin and 9/17 and 3/17 had darker hair and skin than expected; for rs1129038, 6/16 patients had darker eyes than expected. 4) Regarding genetic analysis, our data suggest that analysis of GNPTG and GNPTAB can be done by next generation sequencing, and that the identification of pathogenic mutations which segregate in family is of paramount importance for the identification of heterozygotes and for conducting prenatal diagnosis. Conclusion: This is the first case series of patients ML II / III in Brazil, where ML II seems to be the most common type. Moreover, the ML II / III has delayed diagnosis, multisystemic symptoms, and appear to display changes in melanogenesis (as most common, Hypomelanosis), but further studies are needed to confirm these findings. Taking into consideration the enzymes evaluated in this study, we suggest measurement of plasma and fibroblast levels of at least three of the enzymes which had the highest scores in our analysis. This enzyme panel proposes to be a faster, simpler, and less expensive method for biochemical diagnosis. The next generation sequencing seems to be a good alternative for diagnostic confirmation of these patients.