Desenvolvimento de linhagem humana de adenocarcinoma pulmonar knockout para o gene da Cofilina-1 via CRISPR/Cas9

Abstract

O câncer de pulmão de não pequenas células (CPNPC) representa aproximadamente 85% de todos os carcinomas pulmonares. Mundialmente, a alta mortalidade associada ao carcinoma pulmonar é intrinsecamente relacionada ao diagnóstico tardio, em que os pacientes são comumente diagnosticados em estágios avançados e/ou disseminados. Apesar dos avanços nas opções para o tratamento, incluindo cirurgia, radioterapia, quimioterapia e terapias direcionadas, o prognóstico permanece ruim, somado ao desenvolvimento de resistências intrínseca ou adquirida frente ao tratamento o que reflete diretamente na baixa sobrevida dos pacientes. Portanto, a caracterização molecular adicional de mecanismos envolvidos na progressão tumoral tem o potencial de identificar novos biomarcadores e alvos moleculares que afetam a progressão da doença e permitem o desenho de novas estratégias terapêuticas. Nesse contexto, dados do nosso grupo de pesquisa demonstraram ineditamente o envolvimento da proteína cofilina-1 (gene CFL1 em humanos) na resistência à cisplatina em CPNPC. A cofilina- 1 é uma proteína citosólica de ~19 kDa que pertence à família da ADF/cofilina, sendo um reconhecido fator de regulação do turnover de actina. Níveis aumentados de cofilina-1 em fenótipos mais agressivos de diversos tipos tumorais são geralmente correlacionados a um pior prognóstico. Dessa forma há a necessidade do desenvolvimento de um modelo knockout para determinar o papel específico desse gene na biologia tumoral. Os recentes avanços na elaboração de ferramentas para a edição genômica sistema CRISPR/Cas9 têm revolucionado a engenharia genética ao permitir a programação de alterações sítio dirigidas utilizando um mecanismo relativamente simples. No presente estudo, esta ferramenta foi aplicada para desenvolver um modelo único em adenocarcinoma pulmonar, o knockout para a proteína cofilina-1, que poderá auxiliar numa melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na biologia da agressividade tumoral. A fim de avaliar o efeito da falta de cofilina-1 sobre a dinâmica da actina, realizamos ensaios de migração por microscopia time-lapse, e no grupo knockout foi observado um significativo aumento de direcionalidade. Ademais, foram mensurados padrões morfométricos e essas caracterizações demonstraram alteração no fenótipo para um tipo mais fusiforme, com o padrão nuclear elipsoide, sugestivo de transição epitéliomesênquima. Esses dados sugerem a robustez do modelo knockout para CFL1, que deverá ser complementado com a avaliação da superexpressão e estudo dos mecanismos moleculares alterados entre os fenótipos wild type, knockout e superexpressão para esse gene.

Non-small cell lung cancer (NSCLC) accounts for approximately 85% of all lung carcinomas. Worldwide, high mortality associated with lung carcinoma is intrinsically related to late diagnosis, where patients are commonly diagnosed in advanced and / or disseminated stages. Despite advances in treatment options, including surgery, radiotherapy, chemotherapy and targeted therapies, the prognosis remains poor, coupled with the development of intrinsic or acquired resistance to treatment - which directly reflects the patients' poor survival. Therefore, the additional molecular characterization of mechanisms involved in tumor progression has the potential to identify new biomarkers and molecular targets that affect the progression of the disease and allow the design of new therapeutic strategies. In this context, data from our research group have unprecedentedly demonstrated the involvement of cofilin-1 protein (CFL1 gene in humans) in cisplatin resistance in NSCLC. Cofilin-1 is a ~19 kDa cytosolic protein that belongs to the ADF/cofilin family, being a recognized regulator of actin turnover. Increased levels of cofilin-1 in more aggressive phenotypes of various tumor types are generally correlated with a worse prognosis. Thus, there is a need to develop a knockout model to determine the specific role of this gene in tumor biology. Recent advances in the elaboration of genomic editing tools - CRISPR/Cas9 system - have revolutionized genetic engineering by allowing the programming of site-directed changes using a relatively simple mechanism. In the present study, this tool was applied to develop a unique model in lung adenocarcinoma, the knockout for the cofilin-1 protein, which may help to better understand the mechanisms involved in the biology of tumor aggressiveness. In order to evaluate the effect of the lack of cofilin-1 on actin dynamics, we carried out migration tests by time-lapse microscopy, and in the knockout group a significant increase in directionality was observed. In addition, morphometric patterns were measured and these characterizations demonstrated a change in phenotype for a more fusiform type, with the ellipsoid nuclear pattern, which suggests epithelial-mesenchymal transition. These data indicate the robustness of the knockout model for CFL1, which should be complemented with the evaluation of overexpression and with the study of the molecular mechanisms altered among the phenotypes wild type, knockout and overexpression to this gene.