Processos oxidativos, inflamatórios e alterações comportamentais induzidas por ácido hexacosanóico na adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo x e o efeito de antioxidantes

Abstract

Adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (X-ALD) é um erro inato do metabolismo dos peroxissomos, com incidência de 1:21.000 para homens hemizigotos e 1:14.000 para mulheres heterozigotas. A doença se caracteriza pelo acúmulo de ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA – do inglês very long chain fatty acids), principalmente os ácidos hexacosanóico (C26:0) e tetracosanóico (C24:0) em fluidos e tecidos corporais, podendo causar insuficiência adrenal e grave desmielinização. É causada por mutações no gene ABCD1, o qual codifica uma proteína responsável por transportar VLCFA do citosol para dentro do peroxissomo para serem oxidados. Apesar dos mecanismos relacionados ao dano tecidual ainda não estarem bem elucidados, estudos vêm mostrando que o acúmulo de metabólitos tóxicos, a inflamação e o estresse oxidativo podem estar relacionados com a fisiopatologia da X-ALD. O tratamento para X-ALD é ainda considerado experimental, não havendo nenhuma terapia satisfatória. Alguns estudos vêm investigando as propriedades antioxidantes e antiinflamatórias de n-acetil-L-cisteína (NAC), rosuvastatina (RSV) e trolox (TRO – análogo hidrossolúvel da vitamina E) em doenças relacionadas ao estresse oxidativo. Considerando o exposto, os objetivos deste trabalho foram: avaliar o perfil inflamatório em pacientes com diferentes fenótipos para X-ALD, verificar o efeito in vitro de diferentes antioxidantes sobre parâmetros de estresse oxidativo e inflamação em células gliais enriquecidas com C26:0 (modelo in vitro da X-ALD) e em fibroblastos de pacientes heterozigotas e hemizigotos assintomáticos e, por fim, verificar as alterações comportamentais de ratos Wistar selvagens submetidos à injeção de C26:0. No que concerne aos resultados referentes à avaliação da inflamação em pacientes X-ALD, que estão representados no artigo 1 publicado, podemos inferir que o aumento de citocinas plasmáticas em pacientes assintomáticos poderia ser considerada um biomarcador precoce de progressão da doença e dano neurológico, uma vez que pacientes assintomáticos apresentaram níveis elevados das citocinas pró-inflamatórias IL-1β, IL-2 , IL-8 e TNF-α e altos índices de anti-inflamatórias IL-4 e IL-10, como uma tentativa de contrabalancear o status inflamatório. Além disso, pacientes com fenótipo Adrenomieloneuropatia (AMN) apresentaram altos índices de TNF-α e IL-2 (pró-inflamatórias), bem como IL-5 e IL-4 (anti-inflamatórias). É possível supor que a inflamação na X-ALD possa estar relacionada à concentração plasmática de VLCFA, visto que verificamos uma positiva correlação entre níveis de C26:0 e citocinas pró-inflamatórias em pacientes assintomáticos e AMN, assim como uma correlação negativa entre citocinas anti-inflamatórias e a razão C24:0/C22:0 (ácido docosanóico) em pacientes AMN. Em relação aos resultados referentes à cultura de células gliais (apresentados no artigo 2 publicado), podemos sugerir que o C26:0, por si só, tem a capacidade de alterar o status redox, de causar dano oxidativo ao DNA, estresse nitrativo e inflamação em células gliais. Ainda, verificamos que os três compostos NAC, TRO e RSV tiveram a capacidade de atenuar alguns danos causados pelo C26:0 nas células. O artigo 3 mostra que fibroblastos de pacientes assintomáticos, tanto hemizigotos quanto heterozigotas, quando tratados com NAC e RSV, liberaram menores níveis de DCF em comparação aos fibroblastos não tratados. Ainda, a NAC mostrou-se capaz de aumentar as atividades das enzimas superóxido dismutase e catalase nos fibroblastos dos pacientes, entretanto NAC e RSV não foram capazes de alterar o estresse nitrativo nos fibroblastos. Os resultados referentes ao artigo 4 mostram evidências que o C26:0, ao ser administrado em ratos Wistar, pode causar alterações comportamentais, como prejuízo locomotor, diminuição da capacidade exploratória e redução de respostas de orientação-investigação. Considerando nossos resultados, deduzimos que o C26:0, principal metabólito acumulado na doença, está relacionado com os danos encontrados na X-ALD, e que futuros estudos abordando sua toxicidade e efeitos possam ser de suma importância para o desenvolvimento de um tratamento capaz de reduzir os niveis plasmáticos e teciduais nos pacientes afetados. Ainda, concluímos que o estudo de antioxidantes são de grande relevância em um tratamento adjuvante para X-ALD, visto que ainda não há nenhuma terapia satisfatória para este grave erro inato do metabolismo.

X-linked adrenoleukodystrophy (X-ALD) is an Inborn Error of Peroxisome Metabolism, with an incidence of 1: 21,000 for hemizygotes men and 1: 14,000 for heterozygotes women. This disease is characterized by accumulation of very long chain fatty acids (VLCFA), mainly hexacosanoic (C26:0) and tetracosanoic acids (C24:0) in body fluids and tissues, which may cause adrenal insufficiency and severe demyelination. It is caused by mutations in the ABCD1 gene, which encodes a protein responsible for transporting VLCFA from the cytosol into the peroxisome to be oxidized. Although mechanisms related to tissue damage have not yet been well elucidated, studies have shown that the accumulation of toxic metabolites, inflammation and oxidative stress may be related to the pathophysiology of X-ALD. Treatment for X-ALD is still considered experimental and there is no satisfactory therapy. Some studies have investigated the antioxidant and anti-inflammatory properties of n-acetyl-L-cysteine (NAC), rosuvastatin (RSV) and trolox (TRO - water-soluble analog of vitamin E) in diseases related to oxidative stress. Considering the above, the aims of this work were: to evaluate the inflammatory profile in patients with different phenotypes for X-ALD, to verify the in vitro effect of different antioxidants on parameters of oxidative stress and inflammation in glial cells enriched with C26:0 (in vitro model for X-ALD) and in fibroblasts from asymptomatic heterozygote and hemizygote patients and, finally, to verify the behavioral changes of wild Wistar rats submitted to C26:0 injection. Concerning the results regarding the evaluation of inflammation in X-ALD patients, which are represented in article 1, we can infer that the increase of plasmatic 14 cytokines in asymptomatic patients could be considered an early biomarker of disease progression and neurological damage, since asymptomatic patients had elevated levels of proinflammatory cytokines IL-1β, IL-2, IL-8 and TNF-α and high levels of anti-inflammatory IL-4 and IL-10 as an attempt to counterbalance the inflammatory status. In addition, patients with Adrenomieloneuropathy (AMN) phenotype had high levels of TNF-α and IL-2 (pro-inflammatory), as well as IL-5 and IL-4 (anti-inflammatory). It is possible to suppose that the inflammation in X-ALD may be related to the plasmatic concentration of VLCFA, since we found a positive correlation between levels of C26:0 and pro-inflammatory cytokines in asymptomatic patients and AMN, as well as a negative correlation between anti-inflammatory cytokines and C24:0/C22:0 ratio (docosanoic acid) in AMN patients. Regarding glial cell culture results (presented in article 2), we may suggest that C26:0, by itself, has the ability to alter redox status, cause oxidative DNA damage, nitrative stress, and inflammation in glial cells. Furthermore, we verified that the three compounds NAC, TRO and RSV had the ability to attenuate some damage caused by C26:0 in the cells. Article 3 shows that fibroblasts from asymptomatic patients, both hemizygotes and heterozygotes, when treated with NAC and RSV, released lower levels of DCF compared to untreated fibroblasts. In addition, NAC was able to increase the SOD and CAT enzymes activity in patients fibroblasts, however NAC and RSV were not able to alter nitrative stress in fibroblasts. The results from article 4 show evidence that C26:0, when administered in wild Wistar rats, can cause behavioral changes, such as locomotor impairment, decreased exploratory capacity and reduction of orienting-investigatory responses. Considering our results, we deduce that C26:0, the main metabolite accumulated in the disease, is related to the damages found in X-ALD, and that future studies addressing its toxicity and effects may be of great importance for the development of a treatment capable of reduce plasmatic and tissue levels in affected patients. Further, we conclude that a study with antioxidants are relevant in an adjuvant treatment for X-ALD, since there is still no satisfactory therapy for this severe inborn error of metabolism.