Isquemia e reperfusão normotérmica hepática e efeitos do alopurinol : estudo experimental em ratos

Abstract

Evidências acumuladas em diversos estudos tem demonstrado que as Espécies Ativas do Oxigênio (EAO) contribuem para o dano celular decorrente da isquemia e reperfusão de órgãos, principalmernte, em função da propriedade oxidativa das mesmas sobre os constituintes lipídicos das membranas celulares. O alopurinol tem sido sugerido como droga capaz de interferir beneficamente diminuindo o dano celular decorrente da reperfusão de órgãos previamente isquêmicos, tendo em vista o seu potencial de inibir a enzima xantina-oxidase, a mais frequentemente referida como geradora de EAO. Este estudo foi desenvolvido como o objetivo de avaliar os efeitos da isquemia e reperfusão hepática em ratos e também os efeitos do prétratamento com o alopurinol, sobre a função deste órgão, lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos e, características histopatológicas decorrentes. Para tanto, ratos Wistar, pesando entre 250 e 300 gramas foram utilizados e divididos em 6 experimentos interdependentes. Experimento 1: realizado para avaliar os efeitos de diferentes procedimentos sobre a função hepática. Os animais foram divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia troncular total e intermitente durante um tempo de 45 minutos, tendo sido permitida a reperfusão durànte 5 minutos após os dois primeiros intervalos de 15 minutos; Grupo 3- ratos submetidos a hepatectomia parcial (lobo médio e esquerdo); Grupo 4- ratos submetidos a isquemia conforme descrito e, no final do período, a hepatectomia parcial como no grupo anterior. Colheitas de sangue 12, 24, 48, 72, 96, 120 horas e no 14, 21 e 28 dias foram obtidas para determinação da atividade das transaminases oxalo-pirúvicas (AL T), oxaloacética (AST) e fosfatase alcalina (FA). Experimento 2: realizado para avaliar o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos, através dos métodos de Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS) e da Quimiluminescência (QL), em diferentes tempos de reperfusão sanguínea. Para tanto, 40 ratos foram utilizados e divididos em 4 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1: ratos controle (submetidos a laparotomia); Grupo 2- ratos submetidos a isquemia total durante 60 minutos não tendo sido permitida a reperfusão; Grupo 3- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por 30 minutos; Grupo 4- lsquemia total de 60 minutos e reperfusão por igual tempo. A ressecção do lobo médio, ao final de cada tempo operatório, foi realizada e, o tecido removido utilizado para medidas do grau de lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 3: realizado para avaliar os efeitos do alopurinol sobre a função hepática em situações de isquemia e reperfusão. Para tanto 30 ratos foram utilizados, e divididos em 3 grupos de 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- lsquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente; Grupo 3- ratos submetidos a isquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Medidas da ALT, AST e FA foram realizadas 12, 24, 48 e 72 horas após os procedimentos. Experimento 4: avaliar o efeito do alopurinol sobre o grau de lipoperoxidação das membranas celulares dos hepatócitos. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos com 1 O animais cada: Grupo 1- ratos controle, submetidosum período de anestesia e laparotomia de 1 hora e 45 minutos; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora porém, pré-tratados com suspensão de alopurinol conforme descrição prévia. Grupo 3- ratos submetidos a isquemia de 45 minutos e reperfusão de 1 hora. Após os respectivos tempos operatórios,os animais foram submetidos a ressecção do lobo médio, utilizado para as medidas da lipoperoxidação pelos métodos do TBARS e QL. Experimento 5: avaliar os efeitos do alopurinol sobre a mortalidade pósoperatória em ratos submetidos a isquemia e reperfusão. Para tanto, 30 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo durante 45 minutos, porém com pré-t r~tamento com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. Experimento 6: avaliar as alterações histopatológicas da isquemia hepática em ratos pré-tratados e não com alopurinol. Para tanto, 60 ratos foram utilizados e divididos em 3 grupos de 20 animais: Grupo 1- ratos controle, submetidos ao pré-tratamento com 50 mg/ Kg de peso da suspensão de alopurinol 5 e 1 hora antes da laparatomia, sem nenhum procedimento adicional; Grupo 2- ratos submetidos a isquemia seletiva do lobo médio e esquerdo, durante 45 minutos, porém em ratos pré-tratados com suspensão de alopurinol nas doses descritas anteriormente. Grupo 3- lsquemia seletiva conforme descrito anteriormente. A cada 24 horas durante 4 dias, 5 animais de cada grupo eram sacrificados e, os lobos médio e esquerdo foram removidos para estudo histopatológico. Experimento 1- Significativa elevação nas concentrações séricas, nas medidas das 12 e 24 horas após o procedimento, das enzimas AL T e AST foram observadas nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) (p<O.OS). Além disso, naqueles animais do Grupo 4 elevações mais pronunciadas foram eveifenciadas em relação aos demais grupos nas determinações efetuadas 12, 24 e 48 após a cirurgia (p<O.OS). A soma dos valores das medidas individuais dos Grupo 2 e 3 não se distinguiram daquelas obtidas no Grupo 4 (p>O.OS). A concentração sérica da FA foi mais elevada em todas as determinações efetuadas naqueles animais submetidos a hepatectomia (G.3 e 4) em relação aos grupos de animais nos quais este procedimento não foi efetuado (Grupos 1 e 2) (p<O.OS). Experimento 2- Foi observado uma maior formação de malondialdeído (TBARS) nos tecidos hepáticos dos Grupos 3 e 4 em relação aos Grupos 1 e 2 (p<O.OS) e, além disso, ausência de diferença entre os Grupos 3 e 4 e entre os Grupos 1 e 2 (p>O.OS). Resultados semelhantes foram obtidos pelo método da QL. Experimento 3- A concentração sérica da AL Te AST foi superior (p<O.OS) nos Grupos 2 e 3 em relação ao grupo controle (Grupo 1) nas medidas efetuadas 12 e 24 horas após o procedimento e, nas determinações das 48 horas do Grupo 3 em relação aos demais (p<O.OS). A FA foi semelhante em todos os grupos de animais (p>O.OS). Experimento 4- A formação de malondialdeído foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos Grupo 1 e 2 (p<O.OS). Entre estes dois últimos grupos não houve diferença estatisticamente detectável (p>O.OS). Além disso, a QL demonstrou uma maior emissão de energia luminosa no Grupo 3 em relação aos demais (p<0.05) e, entre estes dois últimos os resultados foram semelhantes (p>0.05). Experimento 5- A taxa de mortalidade no grupo de animais submetidos a isquemia sem pré-tratamento como alopurinol (Grupo 3) foi de 40% nas primeiras 24h após o procedimento, estatisticamente distinta quando comparado ao Grupo 1 (cbntrole)(p<0.05). Entretanto, entre os animais do Grupo 2, ou seja, submetidos a isquemia e pré-tratamento com alopurinol, 13.3% foram ao óbito e este valor não se distingue dos animais do Grupo 1 (p>0.05). A avaliação entre os Grupos 2 e 3 não demonstrou diferença estatística (p>0.05). A mortalidade na avaliação das 48 horas foi igual entre os dois grupos (6.6% e 6.6%) (2 e 3) e não distintas, estatisticamente (p>0.05). Os demais animais sobreviveram durante o período de observação. Experimento 6- Congestão vascular hepática e necrose hepatocitária foram significativamente mais pronuncidas nos animais dos Grupos 2 e 3 em relação aos animais do grupo controle na avaliação efetuada 24 e 48 horas após a isquemia (p<0.05) e, além disso, a necrose foi maior nos animais do Grupo 3 em relação aos do Grupo 2 (p<0.05) apenas na avaliação das primeiras 24 horas após o procedimento cirúrgico. Não se observaram diferenças estatisticamente demonstráveis nas avaliações realizadas 72 e 96 horas após a cirurgia(p>0.05). Estes resultados sugerem que a via da xantina oxidase é uma das mais importantes rotas metabólicas envolvidas na geraçãode EAO, elementos quimicamente reativos e com potencial lesivo ao nível das membranas celulares dos hepatócitos e, que pelo menos em parte, são responsáveis pelos danos funcionais do fígado na síndrome da isquemia e reperfusão. Além disso, o alopurinol demonstrou efeitos protetores contra a lipoperoxidação decorrente da injúria reperfusional, embora a análise histopatológica não tenha demonstrado uma diferença estatisticamente significativa, o que pode ser justificado pelo fato das alterações provocadas nesta síndrome ocorram a nível de biomembranas celulares e de organelas não adequadamente visualizáveis pela microscopia óptica.

lt has been demonstrated that the oxygen free radical (EAO) contributes to the cellular damage induced by ischemia/reperfusion, probably mainly due to its lipid-oxidative characteristics. lt has been suggested that allopurinol has beneficiai effects in reducing the injury due to the reperfusion of previously ischemic organs, in this syndrome, as a result of its property of inhibiting the enzyme xanthine oxidase, most frequently referred as responsible for the EAO generation. This study was carried out with the purpose of elucidating the effects of hepatic ischemia-reperfusion in rats, the effects of allopurinol in this syndrome, the development of the assay for lipid peroxidation of hepatocyte membranes and the histopathologic features. To achieve this goal, the functional repercussion and the histopathologic features (analized 24 hours and eight days after surgery) were evaluated in wistar rats weighing 250-300 g. Experíment 1: performed for evaluating the way in which different procedures reflected upon the hepatic function. The animais were divided into 4 groups of 1 O rats each. Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total intermittent hepatic ischemia for 45 minutes: the first two 15-minute periods of ischemia were intercalated with 5 minutes of reperfusion; Group 3- rats which underwent partia! hepatectomy (mediai and left lobes). Group 4- lschemia as described above and at the end of partia! hepatectomy. Blood samples were obtained at 12, 24, 48, 72, 96 and 120 hours and 4, 21 and 28 days after the procedure to determine the leveis of the enzymes oxalopiruvic transaminase (AL T), oxaloacetic transaminase (AST) and alkaline phosphatase (AF). Experiment 2: performed for evaluating the lipoperoxidation of hepatocyte membranes by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL) at different times of reperfusion. The animais were divided into 4 groups of 10 rats each: Group 1- Contrais (sham operation); Group 2- rats submitted to total hepatic ischemia for 60 minutes ; Group 3- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 30 minutes; Group 4- total hepatic ischemia for 60 minutes and reperfusion for 60 minutes. At the end of each operation time, a resection of the mediai lobe was performed, and hepatic tissue was removed and used for measuring lipid peroxidation by the methods described above. Experiment 3: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatic function in the setting of ischemia-reperfusion. The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. Blood samples were obtained 12, 24, 48 and 72 hours after the procedure to determine the activities of the AL T, AST and AF enzymes. Experiment 4: performed for evaluating the effects of allopurinol on hepatocyte membrane lipoperoxidation by the methods of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) and Chemoluminescence (QL). The animais were divided into 3 groups of 1 O rats each: Group 1- Contrais (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 60 minutes of reperfusion and treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and reperfusion during 60 minutes. After the respective surgical times, the left and mediai lobes were removed and used for the lipoperoxidation assay by the TBARS and QL methods. Experiment 5: performed for evaluating the effects of allopurinol on mortality after the ischemia-reperfusion procedure. Forty animais were used and divided into 3 groups: Group 1- 10 control rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure with two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- 15 rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3: 15 rats submitted to 45 minutes of selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia followed by 5 minutes of reperfusion 22,5 minutes later. The animais were observed for 7 days after the procedure. Experiment 6: performed for analyzing the hepatic histopathologic features and the effects of the pre-treatment wíth allopurinol in the rats submitted to ischemia-reperfusion. Sixty animais were used and divided into three groups of twenty animais each: Group 1- Contrai rats (sham operation) treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 2- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes and treated 5 hours and 1 hour before the procedure wíth two doses of 50 mg/kg of allopurinol suspension administered intraperitoneally; Group 3- rats submitted to selective (mediai and left lobes) hepatic ischemia during 45 minutes. Twenty-four, 48, 72 and 96 hours after the procedure, 5 rats of each group were sacrificed, and their left and right lobes were removed for histopathologic study (vascular congestion, necrosis and steatosis). Experiment 1: The determination of the AL T and AST leveis, after the procedure, demonstrated that these leveis were significantly higher in the groups 2 and 3 than in group 1 (p<0,05). Besides, among the animais of ali groups, those of group 4 had the highest leveis 12, 24 and 48 hours after the surgery. When the values of group 3 were added to the values of group 2, the results were not different from the values of group 4 (p>0,05). AF was higher in ali determinations, in the animais which underwent hepatectomy (groups 3 and 4) compared to those which were not submitted to this procedure (groups 1 and 2) (p< 0,05). Experiment 2: Malondialdehyde (TBARS) formation was higher in the groups 3 and 4 than in the groups 1 and 2 (p<0,05); besides, no difference was observed between the groups 3 and 4 and between the groups 1 and 2 (p>0,05). Similar results were observed with the QL method. These results suggest that the enzyme xanthine oxidase is one of the most important pathways involved in the generation of the EAbs, chemical reactive elements with injury potential at the levei of the hepatocyte membranes in the ischemia-reperfusion syndrome. At last, the results showed that allopurinol had beneficiai effects on hepatic function and lipid peroxidation and protective effects against hepatic ischemia-reperfusion injury. The histopathologic findings can be explained by the fact that the changes induced by this mechanism occur in organelles and biomembranes which are not visualized by light microscopy.