Inibição terapêutica da interação MDM2-p53 : uma alternativa para o tratamento do carcinoma adenoide cístico

Abstract

Introdução: O carcinoma adenoide cístico (CAC) é uma das neoplasias de glândula salivar mais comuns para o qual não se encontra quimioterapia eficaz. Um conceito emergente na terapia do câncer é atingir proteínas especificas do tumor. MDM2 (murine double minute 2) é um importante inibidor do supressor tumoral p53, e sua expressão é aumentada em CAC. O objetivo do Artigo 1 foi avaliar o efeito de um novo inibidor da interação MDM2-p53 (MI-773) no CAC in vitro e in vivo. O Artigo 2 teve como objetivo entender o papel da combinação de MI-773 com cisplatina, além de avaliar a recorrência de CAC frente a regime neoadjuvante de MI-773. Materiais e Métodos: 3 modelos de xenoenxerto derivado de paciente (XEDP, UM-PDXHACC- 5; ACCx6; ACCx9) e 5 culturas primarias de CAC (UM-HACC-1, -2A, -2B, -5, -6) foram usados para experimentos in vitro e in vivo. Ensaio de Sulforrodamina B (SRB) foi realizado para avaliar o efeito dos agentes experimentais na viabilidade celular, além de determinar valores de IC50. Western blots revelaram a expressão de p53, fosfo-p53, MDM2, p21, PUMA, BAX, Bcl-2 e Bcl-xL. Lâminas histológicas (UMPDX- HACC-5) foram avaliadas por imunohistoquímica e imunofluorescência para determinar a localização de p53. Técnica de TUNEL in situ revelou o número de células de UM-PDX-HACC-5 no processo de apoptose. Citometria de fluxo foi realizada para determinar o efeito da terapia na proporção de células-tronco tumorais (ALDHhighCD44high) e para avaliar o ciclo celular. Para os estudos in vivo, animais transplantados com tumores (UM-PDX-HACC5, ACCx6, ou ACCx9) receberam protocolo terapêutico (MI-773 – gavagem; cisplatina – injeção intraperitoneal; ou veículo controle) conforme indicado. ANOVA, seguido de testes post-hoc (Tukey), Mann-Whitney U-test ou Student’s t-test foram usados para determinar as diferenças no crescimento tumoral, peso, volume, apoptose, viabilidade celular, expressão de TUNEL e p53. Significância estatística: p<0.05. Resultados: MI-773 causa regressão do tumor em todos os modelos préclínicos de CAC. Doses diárias de 100mg/kg de MI-773 reduziram significativamente o volume tumoral quando comparado com doses intermediárias (10 ou 50 mg/kg MI-773) ou veículo controle, em todos os modelos de CAC. Alternativamente, camundongos transplantados com tumores UM-PDX-HACC-5 receberam doses semanais de MI-773 (200 mg/kg) e/ou cisplatina (5 mg/kg) por 30 dias, a fim de se avaliar o efeito da combinação das drogas. MI-773, como agente único, causou regressão tumoral, sendo mais efetivo do que a cisplatina. Cisplatina, por outro lado, mostrou limitado efeito terapêutico, estabilizando o crescimento tumoral. Notavelmente, a combinação MI-773 + cisplatina foi mais efetiva do que os agentes isoladamente, e não foi verificada retomada do tumor no período pósoperatório. Importantemente, os protocolos experimentais não comprometeram a saúde geral dos animais. Coletivamente, estes resultados in vivo demonstram que MI-773 atua como mediador na regressão tumoral de CAC e sensibiliza os tumores à cisplatina. A inibição terapêutica da interação MDM2-p53 ativa p53 e induz apoptose. MI-773 potentemente induz expressão de p53, seu alvo p21 e proteínas relacionadas à apoptose, como PUMA, BAX, Bcl-2 e Bcl-xL in vitro e in vivo. Análise do ciclo celular mostrou que a inibição terapêutica da interação MDM2-p53 por MI- 773 causa parada no ciclo celular no primeiro ponto de checagem (G1). Marcação por TUNEL revelou número significativamente maior de células em apoptose quando tumores de UM-PDX-HACC-5 foram tratados com MI-773 em comparação com controle (p<0.05) Utilizando o mesmo modelo de xenoenxerto, a técnica de imunohistoquímica mostrou que MI-773 não somente aumentou a porcentagem de células p53-positivas (p<0.001), como causou uma translocação parcial de p53 ao citoplasma. MI-773 reduz a fração de células-tronco tumorais (CTT) e previne recorrência do CAC. Tratamento com MI-773 como agente único ou combinado com cisplatina reduziu a fração de CTT (p<0.05). Notavelmente, nenhum animal tratado com regime neoadjuvante de MI-773 apresentou recorrência tumoral mesmo após 300 dias de acompanhamento. Em contraste, em 62,5% dos animais do grupo controle houve recorrência (p=0.0097). Conclusões: Em resumo, os estudos demonstram que a inibição terapêutica da interação MDM2-p53 com MI-773 é uma estratégia antitumoral eficaz, é capaz de sensibilizar tumores à cisplatina e previne recorrência neste modelo pré-clínico de CAC. Coletivamente, os dados sugerem que pacientes com carcinoma adenoide cístico podem ser beneficiados através de terapias-alvo contra MDM2.

Introduction: Adenoid cystic carcinoma (ACC) is one of the most common salivary gland malignancies for which no effective chemotherapy is available. An emerging concept in cancer therapy is to target specific tumor-related proteins. Murine double minute 2 (MDM2) is an important inhibitor of the tumor suppressor p53 and has been found overexpressed in ACC. Paper #1 aimed to evaluate the effect of a novel small molecule inhibitor of the MDM2-p53 interaction (MI-773) on ACC in vitro and in vivo. Paper #2 aimed to understand the role of combining MI-773 with cisplatin, and to evaluated ACC recurrence using a neoadjuvant regimen of MI-773. Material and Methods: 3 patient-derived xenograft (PDX) models (UM-PDX-HACC-5; ACCx6; ACCx9) and 5 low passage primary human ACC cells pools (UM-HACC-1, -2A, -2B, - 5, -6) were used for in vivo and in vitro experiments. Sulforhodamine B (SRB) assay was performed to evaluate the effect of experimental agents on ACC cell viability and to determine IC50 values. Western blots revealed the expression of p53, phosphop53, MDM2, p21, PUMA, BAX, Bcl-2 and Bcl-xL. Histological sections from UM-PDXHACC- 5 tumors were stained using immunohistochemistry and immunofluorescence techniques to determine p53 status. In situ TUNEL staining revealed the number of UM-PDX-HACC-5 cells undergoing apoptosis. Flow cytometry was carried out to determine the effect of therapy on the proportion of cancer stem cells (ALDHhighCD44high) and for cell cycle analysis. For in vivo studies, mice harboring UM-PDX-HACC5, ACCx6, or ACCx9 tumors were treated following specific therapeutic protocol (MI-773 – gavage; cisplatin – intraperitoneal injection; or vehicle control), as opportunely indicated. One-way ANOVA, followed by post-hoc tests (Tukey), Mann-Whitney U-test or Student’s t-test were used to determine significant differences in tumor growth, weight, volume, apoptosis levels, cell viability, TUNEL and p53 expression. Significance was determined at p<0.05. Results: MI-773 caused tumor regression in all ACC PDX models. Daily doses of 100 mg/kg MI- 773 significantly reduced tumor volume when compared to intermediate doses (10 or 50 mg/kg MI-773) or vehicle-treated controls in all ACC xenograft models. Alternatively, mice harboring UM-PDX-HACC-5 tumors received either weekly doses of MI-773 (200 mg/kg) and/or cisplatin (5 mg/kg) for 30 days, in order to evaluate the effect of this drug combination. MI-773 as single agent caused tumor regression, being more effective than single agent cisplatin. Cisplatin showed limited therapeutic response stabilizing tumor growth. Notably, combination of MI-773 with cisplatin was more effective than single agent therapies and no tumor rebound was observed during the follow up period. Importantly, experimental protocols did not compromise the overall health status of mice. Collectively, these in vivo results demonstrate that MI-773 mediates ACC tumor regression, and sensitizes ACC xenograft tumors to cisplatin. Therapeutic inhibition of the MDM2-p53 interaction activates p53 and induces apoptosis. MI-773 potently induced the expression of p53, its downstream target p21 and apoptosis-related proteins PUMA, BAX, Bcl-2 and Bcl-xL in vitro and in vivo. Cell cycle analysis showed that therapeutic inhibition of the MDM2-p53 interaction by MI-773 causes cell cycle arrest at the first checkpoint (G1). In situ TUNEL revealed a significant higher number of cells undergoing apoptosis in UMPDX- HACC-5 tumors treated with MI-773 compared to vehicle control (p<0.05). Using the same xenograft model, immunohistochemistry assay showed that MI-773 not only increased the percentage of p53-positive cells (p<0.001), but also caused a partial translocation of p53 to the cytoplasm. MI-773 reduces the fraction of cancer stem cells (CSC) and prevents recurrence in ACC. Treatment with MI-773 as single agent or combined with cisplatin significantly reduced the fraction of CSC (p<0.05). Notably, not a single animal treated with neoadjuvant MI-773 presented recurrence even after 300 days of follow-up. In contrast, 62,5% of mice that received vehicle control experienced tumor reappearance within this time period (p=0.0097). Conclusions: In summary, these studies demonstrate that therapeutic inhibition of the MDM2-p53 interaction with MI-773 is an effective anti-tumor strategy that mediates tumor regression, sensitizes tumors to cisplatin and prevents recurrence in this pre-clinical model of ACC. Collectively, these data suggest that patients with adenoid cystic carcinoma might benefit from MDM2-targeted therapies.