Engenharia evolutiva aplicada à adaptação da bactéria Klebsiella pneumoniae ao aumento da concentração de glicerol em meios de cultivo

Abstract

Devido as atuais crises políticas e ambientais causadas pelos combustíveis fósseis, busca-se cada vez mais fontes alternativas de energia. Os biocombustíveis, como o biodiesel, representam uma opção viável, sua produção está em expansão e como consequência há um aumento na formação de bioprodutos secundários, entre eles o glicerol. Objetivando reduzir futuros problemas ambientais pelo acúmulo de glicerol e, consequentemente, tornar a produção de biodiesel mais rentável, estão sendo cada vez mais pesquisadas alternativas biotecnológicas que utilizam glicerol como única fonte de carbono para obtenção de produtos de alto valor agregado, atrativos ao mercado, como 1,3-propanodiol (1,3-PD) e etanol, através da fermentação de microrganismos. O meio contendo glicerol residual é bastante inóspito a um microrganismo, neste contexto, o objetivo deste trabalho foi promover a adaptação gradativa de Klebsiella pneumoniae Blh-1 ao meio contendo glicerol residual com o intuito de avaliar o efeito do processo adaptativo na produção de 1,3-propanodiol, etanol, ácido acético e ácido lático. Após a verificação da cinética de consumo de glicerol residual, a bactéria K. pneumoniae Blh-1 foi cultivada em biorreatores operando em fluxo contínuo, como estratégia de engenharia evolutiva. Os biorreatores continham 1,5 L de meio de cultivo em condições anaeróbicas com pH 7, temperatura de 37 oC e agitação de 300 rpm. As entradas e saídas de meio também foram controladas através do uso de bombas com vazão constante em que o meio contendo glicerol residual estéril foi constantemente adicionado em concentrações gradativas crescentes que mudavam a cada 30 h: (g L-1): 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 e 100. Para testar o efeito da engenharia evolutiva sobre a bactéria, as linhagens armazenadas de antes e de depois do cultivo contínuo foram inoculadas em frascos Erlenmeyers de 250 mL, com 50 mL de meio contendo 100 g L-1 glicerol residual e testadas quanto a eficiência de consumo e produção em agitadores orbitais a 150 rpm. O cultivo contínuo, apesar de ter permitido a produção de 1,3-PD e etanol, provavelmente não foi suficientemente longa para permitir uma adaptação ao nível de seleção de mutantes. A linhagem de antes do cultivo contínuo apresentou melhores resultados quanto rendimento (0,47 g g-1) e produtividade (1,51 g L-1 h-1) de 1,3-PD do que a linhagem após o cultivo contínuo (produtividade: 0,40 g g-1 e rendimento 1,35 g L-1 h-1) em agitador orbital 150 rpm, 37 oC em um meio contendo 100 g L-1 de glicerol residual. Mais trabalhos são necessários para aprimorar a seleção da bactéria utilizada ao glicerol residual.

Renewable energy sources are sought in substitution of the political and environmental problems caused by fossil fuels. Biofuels, such as biodiesel, represent a viable option for diesel alternative; its production is expanding and, as a result, there is an increased formation of secondary products, including glycerol. Aiming to reduce future environmental problems by glycerol accumulation and, consequently, turn the biodiesel production more profitable, investigation is being carried out of biotechnological alternatives using glycerol as single carbon source to obtain high value products, attractive to the market, such as 1,3-propanediol (1,3-PD) and ethanol through microbial fermentation. The medium containing raw glycerol is quite inhospitable to a microorganism, in this context, the objective of this work was to promote the gradual adaptation of Klebsiella pneumoniae Blh-1 to the medium containing raw glycerol and rate the effect of the adaptive process in the production of 1, 3-propanediol, ethanol, acetic acid and lactic acid. After evaluating the consumption of raw glycerol by Klebsiella pneumoniae was demonstrated, cultures were run in bioreactors operating under continuous flow, as an evolutionary engineering strategy. The experiments were performed in 2L stirred tank bioreactor fully equipped and controlled to pH 7, temperature of 37 oC, stirring of 300 rpm, and flow controls. The medium with raw glycerol was added with increasing concentrations every 30 h as follows (g L-1 of glycerol) 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100. In order to test the effect of the evolutionary experiment on K. pneumonia, the original strain and the strain submitted to the continuous cultivation, were both inoculated into 250 mL Erlenmeyer flasks with 50 mL medium containing 100 g L-1 of raw glycerol and tested for the consumption and production efficiency in rotary shaker at 150 rpm. Although the bacterium was able to metabolize glycerol and convert it into 1,3-PD and ethanol in continuous cultivation, this was possibly not long enough to allow for a selection of true mutants The strain before consumption showed 0,47 g g-1 of yield and 1,51 g L-1 h-1 of productivity of 1,3-PD and the strain after respectively 0,40 g g-1 and 1,35 g L-1 h-1 , both in rotary shaker at 150 rpm, 37 oC, with medium containing 100 g L-1 of raw glycerol. Further studies are required to improve the evolutionary selection of this bacterium towards raw glycerol.